Wetenschapsforum

Beste Chemieforum,

Ik ben de laatste tijd bezig met het isoleren van DNA uit haren en speeksel (swabs) van paarden. De Chelex methode levert geen optimale zuiverheden, optimaal is tussen de 1,8-2,0 (ratio A260/A280), nu ben ik de fenolchloroform-extractiemethode aan het proberen. Nu heb ik verschillende artikelen gevonden met methodes voor het isoleren van DNA. Protocollen en artikelen zijn onderaan weergegeven.

Ik krijg geen constante waarden, en ik weet niet waaraan dit kan liggen. Ik zal de protocollen uitleggen van elke stap, misschien interpreteer ik wel iets verkeerd zodat de isolatie de verkeerde kant opgaat. Ik neem bij elk experiment een referentiemonster mee (negatieve controle). Ik meet de concentratie en zuiverheid met de Nanodrop.

Bij elk monster stop ik 3 haarwortels in een steriel 1,5 ml epje. Ik volg protocol die ik uit de artikelen heb (zie hieronder)

Soms zie ik een pellet en soms weer niet, de toevoeging van Glycogeen zit ik ook al aan te denken, zodat je kan zien waar je pellet zit. Ik houd wel rekening met de plek van de eventuele pellet door de epjes op een bekende wijze neer te zetten in de centrifuge, zodat ik weet waar de pellet zich gaat vormen. Mijn zuiverheden zijn soms goed, tussen de 1,8 -2,0 (haren), maar als ik het protocol voor (speeksel)swabs uitvoer, dan krijg ik ook zuiverheden van boven de 2, bijvoorbeeld 3,19. Daarnaast heb ik, omdat ik geen zuivere producten kreeg, een Microcon-filtratiestap ipv de ethanolprecipitatie uitgevoerd. Vergeleken met de referentiemonster, krijg ik bij de microcon-monsters error-waarden die niet verholpen kunnen worden. Bij beide protocollen krijg ik bij sommige samples wel optimale zuiverheden en concentraties, terwijl in datzelfde experiment (duplo)monsters ook andere waarden geven, zoals te hoge/lage zuiverheid of negatieve waarden bij de Nanodrop.

Graag wil ik jullie versie en ervaringen weten van fenol/chloroform. Doe ik iets fout in de procedure en waar kan het aan liggen dat ik geen constante waarden krijg? Ik heb natuurlijk bij elk monster 3 haarwortels erin gestopt, waarvan ik niet weet of deze allemaal dezelfde DNA opleveren, dus "echte" duploversies kan ik niet uitvoeren. Hetzelfde met de speekselswabs. Het feit dat ik soms wel goede resultaten krijg en soms niet (op dezelfde dag), betekend dat ik over het algemeen wat fout doe of misschien dat ene monster gewoon goed is geisoleerd en de andere niet.

Ik wil het DNA gebruiken voor STR bepaling, dus andere protocollen die werken zijn ook welkom. (al moeten de protocollen die beschreven staan in de artikelen toch gewoon werken?) Ik heb de beschikking over enkele kitjes van Qiagen/Invitek, maar ik vind deze nog wel veel tijd in beslag nemen en prijzig en de resultaten zijn ook niet altijd constant.

Graag wil ik jullie alvast bedanken voor de tips/opmerkingen die jullie plaatesn. Ik weet gewoon simpelweg niet wat ik "fout" doe.

Groetjes,

DrieCh

Protocol voor paardenhaar (artikel "Implications for the use of horse hair roots as a DNA

source for microsatellite typing" Czech J. Anim. Sci., 50, 2005 (11): 499-502)

Dag 1: Overnacht proteinase K digestie bij 56 °C.

- 3 haarwortels in 500 μl lysisbuffer (10 mM TrisHCL; 50 mM KCL; 0,5% Tween 20)

- extra toevoeging 20 μl Proteinase K (10 mg/ml)

Dag 2: Verwerking monster fenolchloroformextractie en EtOH precipitatie.

- Inactivatie ProtK 10 min. 95°C

#DNA extractie met fenolchloroform (commerciele kant en klaar oplossing van Sigma)

- eendezelfde hoeveelheid fenolchloroform (emulsievorming, goed schudden)

- Centrifugeer 10 min max rpm

- Waterige fase in steriel nieuw epje (waterige fase is de bovenste laag en daarin zit het DNA)

#Precipitatie met 96% Ethanol (EtOH)

- eerst 1/10 hoeveelheid 3M NaAc toevoegen

- 2,5 x volume EtOH (96%) toevoegen

- vortex - incubeer 30 min. nat ijs (0°C) (DNA precipiteerd) Ik heb gelezen dat op nat ijs ook een goed resultaat levert ipv de incubatie bij -20 graden

- Centrifugeer 30 min max. rpm

- Supernatant voorzichtig verwijderen (pellet soms niet zichtbaar, soms wel)

- was pellet met 70% EtOH -> Centrifugeer 15 min max rpm

- Verwijder supernatant voorzichtig

- Droog pellet aan de lucht (15 min)

- Los pellet op in 25 μl TE Buffer

Aangepaste versie van protocol voor swabs (artikel: "Collection of Genomic DNA from Adults in Epidemiological Studies by Buccal Cytobrush and Mouthwash", Vol. 10, 687-696, June 2001 Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention)

- Plaats Swab in 700 Lysis buffer (0,01 M TrisHCL, 0,01 M EDTA; 0,1 M NaCL; 2% SDS)

- vortex - incubeer 10 min bij kamertemperatuur

- 35 ProtK (10 mg/ml) toevoegen

- mix - incubeer 2 uur 58 C

- Swab wordt verwijderd en fenol chloroform extractie wordt uitgevoerd wat hierboven beschreven staat en ethanolprecipitatie, alleen ipv NaAC (3M) wordt er 1/10 2M NaCL toegevoegd, omdat er gewerkt wordt met SDS in de oplossing)

Hoi!

Is er niemand die hier aan/opmerkingen over heeft? Ik hoop echt dat iemand zijn/haar ervaringen kan delen met het gebruik van deze extraciemethode.

Alvast bedankt!

Beste DrieCH,

Ik heb naar de isolatie protocollen gekeken.

Dit ziet er prima uit. Een normale chloroform/fernol extractie niets aan veranderen.

Zelf werk ik met een chloroform extratie.

Hierbij Precipiteer je met iso-propanol. Maar dat maakt niet uit.

Maar nu terug komen op je vragen.

Welkom in de wereld van biologie.

Niet elke isolatie geeft dezelfde resultaten. De ene keer heb je inderdaad een hogere en zuivere opbrengst als de andere keer. Dus is het verstandig om DNA isolaties niet analytisch te bekijken. Als je een opbrengst hebt en deze is aardig zuiver dan heeft het prima gewerkt.

Glycogeen niet nodig. Gewoon centrifugeren en doorwerken een pellet is zeker niet altijd zichtbaar bij kleine opbrengsten die je hebt met een paar haren. Pas na TE additie kom je er goed achter dat je een mooie concentratie hebt.

Microcon-filtratiestap ken ik niet en ook niet aan beginnen met zulke kleine hoeveelheden DNA. Kolommen verbeteren vaak niet de opbrengst maar maakt het alleen maar erger.

Kijk ook naar de 260/230 dan weet je of je nog storende organische stoffen hebt.

Bij een hoge 280/230 hebt je waarschijnlijk bij de waterfase te veel eiwit meegenomen. Dus iets netter pipetteren.

Goed de EtOH 70% laten drogen kan zelfs nog wat langer dan 15 min.

Succes!

MvG Ron