Springen naar inhoud

DNA kloneren


  • Log in om te kunnen reageren

#1

koemelk

    koemelk


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 14 oktober 2009 - 20:28

Hallo,

De afgelopen weken heb ik op school een praktijkopdracht moeten doen.. maar ik vind het erg lastig om het te begrijpen. Nu heb ik voor mezelf op papier gezet hoe ik denk dat het in mekaar zit. Maar nu wil ik vragen of jullie het voor me willen lezen en kijken of het een beetje redelijk in mekaar zit.. Het is nog wat simpel opgeschreven maar het gaat er alleen om dat ik het een beetje snap, de uitwerking doe ik daarna.

We hebben het ampicilline gen uit de plasmide pBR322 geknipt om te zorgen dat hij niet meer werkt en om dat weer te kunnen ligeren, moesten we lambda DNA gebruiken (maakt verder niet uit wat je erin plakt maar anders kun je het niet ligeren.) Hiermee hebben wij de vector pBR322 ampicilline sensitief gemaakt. Ook zit er een Tetracyline (weet niet of ik t goed schrijf) gen in pBR322, om dus te kijken of we het goed gedaan hebben.. Doe je Tetracyline in de LB plaat.. en als het goed is moet je dan nadat je je ligatie erop heb gepipetteerd en t in de stoof hebt gezet kolonies zien. Al zou je Ampilline op de LB plaat doen zal je geen kolonies zien omdat.. ?

Nadat je de ligatie op LB+Tetracyline plaat heb gepipetteerd kun je het daarna wel aanenten op ampicilline platen.. Als je dan een kolonie ziet heb je het niet amp sensitief gemaakt.. als er geen kolonies zijn weet je dat het gelukt is.


Hoop dat het te begrijpen is.. alvast bedankt in ieder geval.

Groetjes,

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

jhullaert

    jhullaert


  • >1k berichten
  • 2337 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 oktober 2009 - 20:47

Het is tetracycline. Voor de rest van je vraag ga je nog even moeten wachten. (op iemand anders :) ;) )

#3

-Lisette-

    -Lisette-


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 oktober 2009 - 21:58

Doordat je het ampicilline resitentie gen eruit hebt gehaald, kan de gesloten vector niet meer tegen ampicilline (amp). Met het amp gen er nog in kan de gesloten vector wel tegen ampicilline. Door na het ligeren en transformatie in bacterien zit er in de gesloten vector een Tet gen. Deze heeft dezelfde functie als een Amp gen, alleen is het nu Tet waar de vector tegen kan. Tet en Amp zijn resistentie genen. Doordat de gesloten vector geen Amp maar wel een Tet bevat kunnen de bacterien:
- met gesloten vector zonder Amp gen maar met Tet gen, groeien op een Tet + plaat. De Tet gen in de vector zorgt ervoor dat de bacterien tegen de Tet kunnen.

- met een open vector groeien niet


[QUOTE] Nadat je de ligatie op LB+Tetracyline plaat heb gepipetteerd kun je het daarna wel aanenten op ampicilline platen.. Als je dan een kolonie ziet heb je het niet amp sensitief gemaakt.. als er geen kolonies zijn weet je dat het gelukt is.

Ik snap niet helemaal wat je hiermee bedoelt. Als je de positieve bacterien uit je Tet+ plaat uitstrijkt op een Amp plaat mag daar niks op groeien omdat de bacterien niet tegen de Amp uit de plaat kunnen omdat deze geen niet de Amp resistentie bevatten.

Ik zou sowieso 1 plaat met Tet nemen en als controle meteen al een Amp plaat.

Hoop dat je er wat aan hebt!

#4

koemelk

    koemelk


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 15 oktober 2009 - 15:49

Heey!

Heel erg bedankt, hier heb ik veel aan! Kan ik eindelijk mijn verslag wat verduidelijken en snap ik het zelf een stuk beter.

Nogmaals dankjewel,

:)

#5

koemelk

    koemelk


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 16 oktober 2009 - 16:22

Ik ben er weer niet helemaal over uit.. Zit nu het verslag te schrijven en heb dit op papier tot ik begon te twijfelen..

Om de vector pBR322 ampicilline sensitief te maken, moet het ampicilline gen uit de plasmide geknipt worden om dus te zorgen dat deze niet meer werkt. Dit word gedaan met twee restrictie enzymen die maar op een plaats knippen in de vector anders word de hele vector in stukjes geknipt en je wilt alleen het ampicilline gen kapot maken. De enzymen die we hiervoor gekozen hebben zijn ScaI en PstI, deze knippen maar ťťn keer en ook nog eens alleen in het gen dat we voor ogen hebben. De reden dat je voor hiervoor twee restrictie enzymen nodig hebt heeft met het ligeren te maken.

De stukjes DNA die geknipt zijn moeten worden gezuiverd en daarop volgt de ligatie.

Nu er een deel uit de plasmide pBR322 is geknipt is het geen geheel meer, het heeft een open stuk die niet aan elkaar geligeerd kan worden. De knipplaatsen van ScaI en PstI kunnen niet samen ligeren omdat het twee verschillende uiteinden heeft, daarom moet je van een ander stuk DNA en in ons geval Lambda DNA met dezelfde restrictie enzymen knippen. De ScaI knip uiteinden zullen dan samen ligeren en de PstI uiteinden ook.

Hierna zal de E.Coli bacterie competent worden gemaakt waardoor het DNA getransformeerd kan worden in de E.Coli. Dit word gedaan door middel van een elelectroshock, hierdoor ontstaan gaten in het celmembraan, waardoor het in te bouwen DNA de cel in kan komen (transformeren). Deze getransformeerde cellen worden uitgestreken op LB platen met de juist toegevoegde antibioticum, in ons geval is dat tetracycline. In onze vector zit namelijk nog een tetracycline gen,


Ik snap nog niet helemaal wat er bedoeld word met: het plasmide ampicilline sensitief maken

Ik snap ook niet waarom we het op tetracycline platen uitstrijken, het is toch de bedoeling om het op ampicilline platen uit strijken, met de nodige controle platen.. en als er dan niks groeit dan weet je dat het gelukt is. Wat is het nut dan om op tetracycline platen te gebruiken?

Wij hebben het dan wel zo gedaan, maar waarom doen we dat? of hebben we het gewoon eigenlijk fout gedaan?

Groetjes,

#6

-Lisette-

    -Lisette-


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 oktober 2009 - 12:26

Ik snap nog niet helemaal wat er bedoeld word met: het plasmide ampicilline sensitief maken

Hiermee wordt bedoelt dat het gen gevoelig wordt voor ampicilline. Sensitief maken is gevoelig maken. In het plasmide zit een Amp gen en deze zorgt ervoor dat als er Amp in de voedingsbodem zit, de bacterien hier tegen kunnen. Normaal zou AMP schadelijk zijn voor de bacterien maar met het Amp gen kunnen ze tegen AMP. Deze Amp gen zorgt ervoor dat de bacterien resistent worden. Hoe dit proces precies gaat weet ik niet.

Ik snap ook niet waarom we het op tetracycline platen uitstrijken, het is toch de bedoeling om het op ampicilline platen uit strijken, met de nodige controle platen.. en als er dan niks groeit dan weet je dat het gelukt is. Wat is het nut dan om op tetracycline platen te gebruiken?


Het nut om Tet platen te gebruiken is het selecteren van je bacterien. Zonder het Amp gen kunnen de bacterien niet groeien op een Amp plaat. Als het gelukt is groeit daar niks. Maar hoe weet je nou of het echt gelukt is? Je neemt ook een controle mee, een Tet plaat, waarop de getransformeerde bacterien wel groeien. Je weet dan dat je bacterien leven, de transformatie overleefd hebben (DNA opgenomen) en de vector na ligeren gesloten is. Een open vector ( een geknipt plasmide) in een bacterie kan niet groeien. De open vector is "stuk" en zodoende kan het DNA in het plasmide niet afgelezen worden, inclusief de resitentie genen en kan dus niet groeien op een resistente plaat. (ook zonder resistentie zouden ze niet moeten groeien, alleen gesloten vectoren in bacterien, kunnen bacterien laten groeien)
Een Tet plus plaat is dus een controle of je ligatie weer gelukt is.
Beste is een Tet plaat voor controle of je ligatie gelukt is, een Amp plaat om te zien of daar niks op groeit, en een lege plaat eventueel. Al is de Tet plaat al een goede controle. Echter zou een lege plaat een controle kunnen zijn als er niks op de Tet plaat groeit. Dit zou dan kunnen zijn door open vectoren of doordat het Tet eruit geknipt zou zijn.
Natuurlijk was het de bedoeling om het Amp eruit te knippen, maar een extra controle is nooit weg.



Wij hebben het dan wel zo gedaan, maar waarom doen we dat? of hebben we het gewoon eigenlijk fout gedaan?

Wat heb je precies gedaan? Tet platen of Amp platen gebruikt?
Wat voor controle zou jij willen doen met Amp platen en dan de benodigde controle platen?
Het is ook handig voor jezelf en het verslag als je figuren/plaatjes gaat maken met wat er in het plasmide zit en op welke plaat je het uitstrijkt. Zo krijg je een visueel beeld van wat je doet en is het sneller te zien waarom je iets zo gedaan hebt.

Succes

#7

koemelk

    koemelk


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 18 oktober 2009 - 15:17

Ik weet nu zo ongeveer wat we gedaan hebben, maar niet wat we eigenlijk nog hadden moeten doen. Nadat we onze ligatie ''monsters'' om het zo maar even te zeggen op de TC+LB platen hebben gepipetteerd, moesten we de volgende dag kijken of er kolonies waren ontstaan. Van de kolonies die ontstaan waren hebben we er ťťn uit beide platen aangeend (geen idee hoe je het schrijft) op weer een nieuwe TC+LB plaat, waarom doen we dit?

Ook bij dagdeel 6, de laatste handelingen dus van dit onderzoek staat dit:


Plasmide isolatie

De transformanten van dag 5 heb je gisteren in kweek gebracht. Je moet nu de plasmides isoleren. Doe dit op twee manieren: 2 niet-reingestreken transformanten met de klassieke alkalische lyse methode van dag 1, en de 2 reingestreken transformanten met de Sigma kolommetjes.

en dit:


Plasmide karakterisatie

Als je de plasmides gezuiverd hebt, dan wil je weten of je de juiste vector nog hebt, en vooral: hoe groot is het insert in de recombinante vector. Bedenk zelf een geschikte methode met restrictie enzymen om dat te doen. Gebruik hiervoor beschikbare restrictieenzymen, en NEBcutter, en werk dit goed uit in de werkplan. Vraag nadrukkelijk toestemming aan je coach. En weet dan dat hoe beter jij je voorbereidt, des te sneller zul je toestemming krijgen. Voer de digesties uit, en controleer de DNA fragmenten op gel.

Vind het wat onduidelijk en wil het liefst alles precies weten hoe het zit, ook omdat het een beetje een zooitje bij ons op school is plaats ik het hier. Docenten mailen nooit terug als je een vraag hebt, dus hoop hier weer wat antwoorden te krijgen..

Veranderd door JulyLing, 18 oktober 2009 - 15:19


#8

-Lisette-

    -Lisette-


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 oktober 2009 - 15:41

Hmmm enige wat ik kan bedenken is het uitdunnen van de kolonies, waarschijnlijk zat je hele plaat vol en kon je moeilijk 1 kolonie eruit halen. Je mag nl altijd maar 1 kolonie gebruiken voor verdere werkzaamheden (anders kun je je samples vervuilen met ander DNA) Maar waarom precies nog een keer uitstrijken weet ik niet. Iemand anders misschien een idee?


Plasmide isolatie

Geen idee, ik doe isolatie altijd met kolommen door 1 kolonie van je plaat op te kweken.


Plasmide karakterisatie

Controle van je plasmide doe je door de gezuiverde plasmide (geisoleerd plasmide) opnieuw te knippen (restrictie) met dezelfde of andere ( wat men zelf wilt) restrictie enzymen. In jouw geval wil je kijken naar je insert dus moet je knippen met dezelfde enzymen als eerst. Gewoon de reactie herhalen zoals je dat deed toen je het AMP gen geknipt hebt. Dus een ligatie met 2 enzymen opzetten en deze zuiveren op een DNA gel en dan bekijken onder UV licht. Laad ook een marker op de gel en voordat je dit alles uitvoert even kijken naar hoe groot de vector is ( kb), wat heb ik eruit gehaald (kb) en wat heb ik voor het AMP gen teruggeplaats (kB). Even kijken hoe groot alles is (kb) zodat je deze waarden weet en deze moet je terug zien op je gel.
Als het goed is krijg je dan 1 groot bandje te zien (de vector) en een kleiner bandje met de grootte van je insert. De grootte van de bandjes moeten overeenkomen met wat je eerder theoretisch op papier hebt gezet.

Hoop dat dit je weer een beetje op weg helpt

Kijk ook even of de NEB site, die heeft veel info over de enzymen en welke buffers je nodig hebt enzo.
Je moet nl even checken of de door jouw gekozen enzymen wel werken in de NEB buffer ed. Mocht je dit online niet vinden, je lab zou een poster of een boek van NEB kunnen hebben met alle gegevens.
(NEB= New England Biolabs )

Succes

#9

koemelk

    koemelk


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 21 oktober 2009 - 12:39

Dankjewel!

Ik heb het verslag bijna afgerond, nog wat kleine vraagjes.. (alweer)

bij de plasmide karakterisatie moet je dus opnieuw knippen met de restrictie enzymen die je had, en daarna vertel je iets over een ligatie, is het de bedoeling dat je het dan ook weer ligeert? Wat wij gedaan hebben is het knippen en dat uit de gel snijden, dat zuiveren en ligeren en daarna op platen zetten. Lijkt mij dat deze handeling niet opnieuw moet worden gedaan, volgens mij begrijp ik je verkeerd ^^

Zou je dit misschien kunnen uitleggen?


In jouw geval wil je kijken naar je insert dus moet je knippen met dezelfde enzymen als eerst. Gewoon de reactie herhalen zoals je dat deed toen je het AMP gen geknipt hebt. Dus een ligatie met 2 enzymen opzetten en deze zuiveren op een DNA gel en dan bekijken onder UV licht.


Volgens mij is onze opdracht ook anders, het enige wat wij wilden doen was het amp gen eruit knippen en om het te ligeren had je ander DNA nodig (in ons geval Lambda). Als plasmide karakterisatie is het dan toch niet logisch om naar je insert te kijken? Zou jij weten wat dan wel de bedoeling zou moeten zijn van die karakterisatie?

Wij hebben namelijk verschillende opdrachten gekregen op school en de uitleg was voor iedereen hetzelfde, en de ťťn moest wel een bepaald stukje erin zetten en de ander meost gewoon er iets uitknippen zodat het niet meer zou werken.

en om nog een stapje terug te gaan naar de ligatie, moesten we bepaalde controles meenemen:

Op een LB +TC plaat de vector + insert
Op een LB+TC plaat demiewater met insert
Op een LB+TC plaat alleen de plasmide(vector pBR322) positieve controle
Op een LB+TC plaat helemaal geen DNA
Op een LB plaat ook helemaal geen DNA

Het is me uitgelegd waarvoor deze controles dienen, maar vond zijn uitleg warrig en onduidelijk, iemand enig idee?

Hoop dat ik t een beetje duidelijk heb omschreven en dat iemand hier misschien ook weer een antwoord op weet.

Veranderd door JulyLing, 21 oktober 2009 - 12:50


#10

-Lisette-

    -Lisette-


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 21 oktober 2009 - 14:04

Ten eerste dat ligeren moet restrictie zijn. Verkeerde term gebruitk sorry
Je knipt ze dus open en dan op een gel.

Zou jij weten wat dan wel de bedoeling zou moeten zijn van die karakterisatie?

je wilt toch weten hoe groot jouw lamda dna is wat je erin hebt gestopt of weet je precies de grootte daar al van?
vanuit dit stukje

Plasmide karakterisatie

Als je de plasmides gezuiverd hebt, dan wil je weten of je de juiste vector nog hebt, en vooral: hoe groot is het insert in de recombinante vector. Bedenk zelf een geschikte methode met restrictie enzymen om dat te doen. Gebruik hiervoor beschikbare restrictieenzymen, en NEBcutter, en werk dit goed uit in de werkplan. Vraag nadrukkelijk toestemming aan je coach. En weet dan dat hoe beter jij je voorbereidt, des te sneller zul je toestemming krijgen. Voer de digesties uit, en controleer de DNA fragmenten op gel.

maak ik op dat je wilt weten of de vector en je insert van de grootte zijn die je verwacht. daarbij check je ook je lege DNA insert.
je wilt kijken naar de juiste vector en de grootte van je insert. Ik zou dat doen door opnieuw te knippen en op een gel te laden met controles. Vraag anders je begeleiders om hulp.

en om nog een stapje terug te gaan naar de ligatie, moesten we bepaalde controles meenemen:

Op een LB +TC plaat de vector + insert
Op een LB+TC plaat demiewater met insert
Op een LB+TC plaat alleen de plasmide(vector pBR322) positieve controle


Het is me uitgelegd waarvoor deze controles dienen, maar vond zijn uitleg warrig en onduidelijk, iemand enig idee?

Maak bij deze platen een tekening van wat zit in de plaat wat zit er in de bacterie en denk dan na wat er zou kunnen gebeuren. Met de uitleg die je gehad hebt zou je dit met een beetje puzzelen kunnen oplossen.
Als je je antwoorden later post dan check ik t wel even.

Hint: wanneer kan de bacterie op een plaat groeien?

en bedoel je met deze
Op een LB+TC plaat helemaal geen DNA
Op een LB plaat ook helemaal geen DNA

geen bacterien aangebracht? of bacterien die niet getransformeerd waren?

Even puzzelen. Je bent er bijna en met de vorige posts kom je heel ver met het antwoord.
Succes





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures