Wetenschapsforum

Hallo mensen,

Van de week heb ik een kleuring gedaan waarbij ik een coupe eerst met een chromogeen (DAB) en daarna een fluorochroom (Alexa488) heb gekleurd om hetzelfde antigen (Ki-67) aan te tonen. De primaire antilichamen binden met verschillende epitopen, ze kunnen dus alle twee binden zonder dat de één de ander verdringt. De kernen zijn ook nog aangekleurd met DRAQ5.

Net keek ik door de microscoop. De DAB heeft het goed gedaan zoals hij het altijd doet, maar de Alexa488 is vals negatief.

De Alexa488 doet het wel, want er is achtergrondkleuring te zien vanwege de dikke coupes (7 micrometer). De Alexa488 is echter compleet negatief op de plekken waar hij positief zou moeten zijn, een zwarte vlek tegen een lichtelijk gekleurde achtergrond.

Nu komt het door de DAB dat het niet gekleurd heeft, maar waarom?

Ik kan een aantal dingen verzinnen, maar ik wil jullie ook graag om advies vragen. Zou de bruine DAB de golflengte opnemen? Of is het ruimtelijk niet mogelijk voor het fluorochroom gebonden antilichaam om te binden nadat de DAB al gereageerd heeft? Maandag ga ik weer een nieuwe serie kleuren terwijl ik in het weekend even ga nadenken welke variaties ik allemaal kan maken.

Alvast bedankt!