Springen naar inhoud

Detectie van eGFP via Western blot


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Wesleyv

    Wesleyv


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 03 december 2010 - 16:03

Ik ben een student aan een hogeschool. En we kregen als opdracht om zelfstandig een protocol te maken voor de detectie van eGFP en deze uit te voeren.

Na een protocol opgemaakt te hebben, die goedgekeurd was door de leerkrachten, begonnen wij aan de uitvoering van onze detectie van eGFP.
De celcultuur die gebruikt werd waren HEK-cellen (293T) die via lentivirale vectoren eGFP bevatten.

De detectie gebeurde met:

- Monoclonaal antilichaam (Clontech; catalog# 632569)
- Geit anti muis IgG antilichaam AP conjugaat (Sigma-Aldrich; catalog# A3688)
- BCIP/NBT (Calbiochem; catalog# 203790)


Volgend resultaat werd bekomen:
Geplaatste afbeelding
http://img809.images.../i/img2246n.jpg

eGFP is 29.8 kDa dus zou wat onder de merker moeten zitten van 32.5 kDa.
Nu zitten er bij de positieve cellen 2 banden te zien. En nog lager een minder duidelijke, afgebroken lijn (stippellijn).

Ik moet binnen een week alles voorleggen aan een jury, en verwacht dus vraagstelling hierover. Alleen kan ik niet direct een antwoord geven.

Het is zeker geen aspecifieke binding van het secundair antilichaam, want dit is daarna getest op een blot en er waren geen banden te zien.

Alternative splicing kan het niet zijn, aangezien het cDNA is, dus is het ofwel aspecifieke binding van het primair antilichaam op een ander eiwit dat op de vector ligt (daar het enkel bij de positieve voorkomt). ofwel een soort glycolisatie
die verschilt afhankelijk van waar het eGFP zich bevindt in de cel. (Maar dit zou dan niet zo'n groot verschil geven denk ik).

En wat zijn die stippellijnen dan?


Ik hoop dat er iemand mij kan helpen,
alvast bedankt,
Wesley Viaene

Veranderd door Wesleyv, 03 december 2010 - 16:05


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Wesleyv

    Wesleyv


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2010 - 13:23

We hebben meerdere lysemethoden uitgeprobeerd (3 in totaal).
Aangezien bij elke lysemethode de banden op eenzelfde hoogte liggen, is de kans klein dat het eiwit afgebroken is.

Ik hoop dat er iemand me kan helpen.
De praktijksessie is al afgelopen, dus ik kan geen onderzoek meer verrichten, maar wel speculeren wat de oorzaak precies zou zijn, dus het zou met echt helpen als iemand mogelijke antwoord(en) kan geven en eventueel hoe je het kan controleren als het effectief zo is (indien mogelijk)

#3

Sjitty

    Sjitty


  • >250 berichten
  • 320 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 april 2012 - 15:12

Ben je zeker van de massa 29.8kDa?

via de sequentie van eGFP (241AA) (http://www.ncbi.nlm....tein/AFA52654.1) kwam ik op : (Expasy)

Mw (average mass): 27184.75 / Mw (monoisotopic mass): 27167.62]

Heb je aspecifieke binding van je primair antilichaam getest met een negatieve controle?

Wat zijn alle verschillende laantjes precies? aangezien ze allemaal wel ergens in verschillen (ook tussen de positieve) kan dat misschien ook nuttige informatie opleveren.

Wat waren de lysemethodes?

Glycosylaties hebben een grotere invloed op de migratiesnelheid dan extra amizonuren met hetzelfde moleculair gewicht. Ze hebben nemen een groter volume in en zijn bovenal veelal vertakt. Zo kan 1 glycosylatie al snel een groot "massa" (massa geinterpreteerd in een gelscheiding) verschil verklaren.(zie een voorbeeld hier Maar het bandje ligt dan uiteraard wel hoger. Het is mogelijk dat het eerste bandje de geglycosyleerde vorm is, en de volgende de ongeglycosyleerde vorm, maar voor die conclusie moet je eerst al zeker zijn van de massa en positie van ongeglycosyleerd eGFP. Verder blijft het een hypothese maar best mogelijk. In de literatuur vind je misschien wel meer info over glycosylatie van(e)GFP.

#4

Sjitty

    Sjitty


  • >250 berichten
  • 320 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 april 2012 - 15:18

Mijn excuses ik heb de datum niet in het oog gehouden. Niet de bedoeling om dit topic te bumpen. Ik zag gewoon een hoop nieuwe topics door die fusie.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures