Springen naar inhoud

Vraag over primer design


  • Log in om te kunnen reageren

#1

BiotechNoob

    BiotechNoob


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 januari 2011 - 15:46

Hoi heb een vraag i.v.m. primer design van PCR. De opgave is :
I would like to clone the horse erythropoietin, and produce the recombinant protein to dope my racing horses. The amino acid sequence of this protein is :
NH2::Met-Gly-Val-Arg-Glu-Cys-Pro-Ala-Leu-Leu-Leu..................//.................Trp-Tyr-Gly-Glu-Ala-Cys-Arg (C-end)

Give me useful suggestions on how to obtain this protein in sufficient amounts.

Vervolgens wordt er wat gezegd over de primer design nl.
-Aminozuren om te zetten in mRNA (reverse translate) of cDNA (codon degeneracy en duid 5' en 3' eind aan)
-Zet mRNA in coding om en template DNA sequence van waaruit het transcribed is (ook 5' en 3' aanduiden)
- Ontwerp primers "to amplify this gene" door PCR (length, degeneracy, proper 3' end seq, indicate 5' en 3')

Voor de oplossing :
begin omzetten naar RNA geeft
5' AUG - GGA,C,G,U - GUA,C,G,U - AGA,G of CGA,C,G,U - GAA,G - UGC,U - CCA,C,G,U - GCA,C,G,U - UUA,G of CTA,C,G,U - idem, idem...........

einde v proteine : UGG - UAC,U - GGA,C,G,U - GAA,G - GCA,C,G,U - UGC,U - AGA,G - CGA,C,G,U - Stop codon (UGA,UAA of UAG) 3'

Daar zit al de eerste vraag waarom wordt er daar een stop codon gezet?


5' Daarna coding :
ATG - GGN- GTN - AGA,G of CGN - GAA,G - TGC,T - CCN - GCN - TTA,G of CTN, idem en idem..........TGG - TAC,T - GGN - GAA,G - GCN - TGC,T - AGA,G of CGN 3'

Daarna worden de eerste 20 geselecteerd in deze coding dus van de eerste A tot en met de 2de C in CCN en er wordt gezegd dat dit een perfect match is. Waarom is dit het geval? Ook moet er een 2de primer gekozen worden?

Als er iemand de oplossing zou hebben voor dit probleem, zou super zijn :)

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

murru

    murru


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 januari 2011 - 18:19

Daar zit al de eerste vraag waarom wordt er daar een stop codon gezet?

In dit eiwit is Arg het meest C-terminale aminozuur, wat logischerwijs betekend dat na dit aminozuur een stop codon volgt.

Daarna worden de eerste 20 geselecteerd in deze coding dus van de eerste A tot en met de 2de C in CCN en er wordt gezegd dat dit een perfect match is. Waarom is dit het geval?

Over het algemeen worden primers gekozen van rond de 20 nucleotiden lang omdat deze de meest optimale condities geven. De laatste twee C"s in de primer zijn een perfect match omdat er geen ambigu´teit kan bestaan over deze basen, d.w.z. de identiteit van deze basen ligt vast.
Het probleem in dit vraagstuk ligt hem voornamelijk in het feit dat je niet weet welke codons worden gebruikt, wat in de meeste gevallen betekend dat de derde base in een codon onbekend is. Het heeft geen zin om hier lang over na te denken, maar zorg in elk geval dat je primers voor ongeveer 50% uit G"s en C"s bestaan. Voor het 3"-einde kan geen ambigu´teit bestaan, omdat er anders een grote kans is dat de primer niet werkt: de primers worden immers verlengd aan het 3"-hydroxyl einde tijdens PCR amplificatie.

Ook moet er een 2de primer gekozen worden?

PCR heeft een forward primer en een reverse primer nodig, dus ja. Lees meer over PCR op het internet als je dit niet weet. Een hint: de reverse primer wordt ook aan het 3"einde verlengd, en moet daarom "reverse complementary" zijn aan de "top DNA strand". Geef ook altijd alle sequenties van 5" naar 3".

Een laatste opmerking:
Ze vragen je uiteindelijk om grote hoeveelheden van dit eiwit te verkrijgen. Vergeet niet een manier te verzinnen om uit de geamplificeerde DNA weer eiwit te winnen.

#3

BiotechNoob

    BiotechNoob


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 januari 2011 - 19:39

Heb nog wat verder gekeken :
De gegeven coding bij de vorige was de 1ste strand waarbij als perfect match eigenlijk de TGC,T - CC wordt gegeven (dus zonder de N)
Zou je kunnen zeggen waarom die N daar niet wordt bijgenomen? Ik neem aan omdat de primer anders inderdaad ambigu wordt aangezien N zowel A,C,G of T kan zijn.
Trouwens bij deze is er toch wel enige ambigu´teit nl C of T bij TGC,T?

Vervolgens wordt er een 2de template gemaakt waarbij alles complementair is aan de eerste met name :
3' TAC - CCN- GAN - TCC,T of GCN - CTC,T - ACA,G - GGN - CGN - AAC,T of GAN - idem - idem..........ACC - ATA,G - CCN - CTC,T - CGN - ACA,G - TCC,T of GCN 5'.

Hierbij wordt volgens de mogelijke oplossing als primer vanaf ACC in het 2de deel tot ACA,G genomen.
Waarom worden er hier 21 nucleotiden gekozen en bij de eerste stand slechts 20 of is dit een fout?

Als perfect match wordt hier ACC - AT (zonder A,G) uit gekozen dat weer een perfect match is blijkbaar.

Alvast bedankt voor je antwoord!

#4

murru

    murru


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 januari 2011 - 20:19

Zou je kunnen zeggen waarom die N daar niet wordt bijgenomen? Ik neem aan omdat de primer anders inderdaad ambigu wordt aangezien N zowel A,C,G of T kan zijn.
Trouwens bij deze is er toch wel enige ambigu´teit nl C of T bij TGC,T?

Die N wordt inderdaad niet meegenomen omdat het 3"einde van de primer zeker moet zijn. Met perfect match hebben ze het waarschijnlijk over de laatste twee C"s en niet over TGC,T. Perfect match is in jouw geval alleen belangrijk aan het 3"-einde omdat daar de primer wordt verlengd tijdens PCR.

Hierbij wordt volgens de mogelijke oplossing als primer vanaf ACC in het 2de deel tot ACA,G genomen.
Waarom worden er hier 21 nucleotiden gekozen en bij de eerste stand slechts 20 of is dit een fout?

Als ik tel worden hier niet 21 nucleotiden genomen, maar 18. Zoals ik al zei, over het algemeen worden primers gekozen van rond de 20 nucleotiden lang.

Als perfect match wordt hier ACC - AT (zonder A,G) uit gekozen dat weer een perfect match is blijkbaar.

ACC-AT is inderdaad een perfect match omdat over deze basen geen ambigu´teit bestaat.

#5

BiotechNoob

    BiotechNoob


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 januari 2011 - 00:10

Ok bedankt!





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures