Springen naar inhoud

DNA-fingerprinting voor genomisch DNA


  • Log in om te kunnen reageren

#1

malupigi

    malupigi


  • 0 - 25 berichten
  • 10 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 10 maart 2011 - 22:43

Hallo,

voor project (een vak dat we hebben) moeten we met behulp van DNA-fingerprinting met restrictie digest en agarose-gel met cybergreen-kleuring, een identificatie maken van een onbekend staal en bepalen of het van dierlijke, plantaardige of bacteriŽle afkomst is. Mijn opdracht is om uit de zoeken hoe ik het genomisch DNA kan knippen (digest) zodat er niet teveel bandjes zijn (een grote smeer) maar ook niet te weinig, anders kunnen we niet identificeren...
Als referentiestalen om mee te vergelijken gebruiken we genomisch DNA van een varken als dierlijk , van e. coli als bacterieel en van 'hedera helix' als plant. Als mogelijke enzymen hebben we in het labo Apai, BamHi, EcoO109i, EcoRi, Hincii, Hindiii, Pvuii, en SnaBi. Welke combinatie van enzymen zouden we het best gebruiken (en eventueel bij welk genomisch DNA) om een normaal resultaat te krijgen? eventueel ook welk percentage agarosegel moet er dan hierbij gebruikt worden?

help me pls want ik begin er echt van te flippen...

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

murru

    murru


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 maart 2011 - 06:34

Wellicht zijn er andere methodes, maar wat ik zou doen is met een aantal restrictie enzymen afzonderlijk digesties maken van het onbekend monster, en daarnaast dezelfde digesties uitvoeren van de referentie monsters.
Puur volgens kanswetten zal het genoom van een varken, wat rond de 3∑109 basenparen groot is, op heel veel plekken geknipt worden met een restrictie enzym wat 6 basenparen herkent. Je zult dus vrijwel altijd een smeer op je gel krijgen. De smeer kan er wel misschien net wat anders uit zien met elke restrictie enzym.
Pak dus een aantal goede enzymen (of nog beter allemaal) en zet afzonderlijke digesties in. Vervolgens laadt je alle digesties op gel(s) en vergelijk je de digestie patronen van het onbekend monster met die van de referentie monsters.
Vergeet niet de concentratie van het DNA in je monsters te bepalen als je een nanodrop of een andere spectrofotometer tot je beschikking hebt. Dit zodat je dezelfde massa DNA kan toevoegen aan elke digestie en later betrouwbaarder 1:1 kan vergelijken.
Aangezien de digesties waarschijnlijk leiden tot relatief grote stukken DNA, zou ik gaan voor een niet al te hoog percentage agarose (~ tussen 0.6% en 1%).

Zoals ik al zei, er zijn vast andere (betere) methodes, maar dit zou theoretisch moeten lukken.

#3

malupigi

    malupigi


  • 0 - 25 berichten
  • 10 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 maart 2011 - 09:41

dat we een digest moesten maken van het onbekende staal en de referentie met dezelfde enzymens wist ik al, anders kan je toch niet vergelijken... Maar is het niet mogelijk om een bepaalde combinatie enkele van de opgegeven enzymen te gebruiken (leerkracht stelde double digest voor) om een redelijk normaal bandenpatroon te bekomen? Want het lijkt me niet de bedoeling om de verschillende smeren te vergelijken, daarmee kan je geen duidelijk ondersheid maken...

#4

murru

    murru


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 maart 2011 - 18:27

Het genoom van een varken is groot. Die van de plant zal ook heel groot zijn. Dit betekent dat je met 1 enzym al een smeer krijgt.
Bedenk nu waarom een dubbele digestie logischerwijs zelfs tot een grotere smeer leidt. Dat je leerkracht dit voorstelde begrijp ik dus niet. Waarschijnlijk is er iets wat jij, of wij beiden, over het hoofd zien.
De enige alternatieve aanpak die ik kan bedenken (omdat je aangaf dat je met cybergreen werkt) is dat al je monsters eerst met hetzelfde enzym knipt en op een gel laadt, zoals ik eerst al voorstelde. Vervolgens gel-extraheer je van allen een klein gebied in de gel van dezelfde hoogte. Tenslotte knip je dit DNA met een ander enzym of enzymen, en laadt je het weer op een gel. Je zou nu wel al een bandenpatroon kunnen gaan herkennen, maar misschien moet je dit proces nog een (aantal) keer herhalen.
De laatste aanpak zal alleen werken wanneer jouw onbekend monster absoluut gelijk is aan 1 van je bekende monsters. Puntmutaties en andere variabelen leiden al heel snel tot een onvergelijkbaar bandenpatroon, zeker tussen twee dieren of twee planten die niet hetzelfde zijn.
Misschien kan je het beste contact opnemen met je leerkracht en eerlijk uitleggen waarom je de opdracht niet snapt.

#5

malupigi

    malupigi


  • 0 - 25 berichten
  • 10 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 13 maart 2011 - 10:52

ik ben een protocol aan het opstellen voor de restrictie-digest maar zit met het probleem dat de incubatietijd afhankelijk is van het aantal Ķg DNA, maar hoeveel Ķl is dat dan ongeveer bij genomisch DNA?

#6

murru

    murru


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 13 maart 2011 - 22:25

Klopt. De incubatietijd kan je baseren op een standaard dat voor het enzym gegeven is. De standaard is vaak de hoeveelheid enzym die nodig is om 1μg Lambda Phage DNA volledig te knippen in 1 uur.

Als je digesties uitvoert in 50μl reacties, dan zou 1-1.5μg genomisch DNA genoeg moeten zijn. Het aantal μl genomisch DNA is dan natuurlijk afhankelijk van de concentratie van je monsters. Ikzelf doe mijn incubatietijden altijd volgens natte-vingerwerk en incubeer vrijwel altijd langer dan de minimale tijd die gegeven is. Houdt wel in gedachten dat sommige enzymen zogenaamde "star-activity" vertonen na te lang incuberen waarbij ze ook buiten hun restrictie plaats knippen.

#7

koenigo

    koenigo


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 31 maart 2011 - 08:07

Misschien kan je het beste contact opnemen met je leerkracht en eerlijk uitleggen waarom je de opdracht niet snapt.

Wij gebruiken alle opgenoemde enzymen ook in het labo (Apai, BamHi, EcoO109i, EcoRi, Hincii, Hindiii, Pvuii, en SnaBi). Als incubatietijd hiervoor gebruiken wij iets tussen een uur, en een uur en half. Dit samen met net iets meer enzymen dan nodig is.

Elektroforese zeker niet lager dan 0,6% (heb eens 0,35% geprobeerd, maar veel gel heb ik achteraf niet meer over gehad).

Of indien je er niet uit komt kan je nog altijd je mede leerlingen om hulp vragen. (die dat bv ook in het project zitten?)





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures