Springen naar inhoud

niet lineair verband concentratie en UV absorptie2


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Skydiver32

    Skydiver32


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 november 2011 - 16:11

Ik moet een HPLC methode valideren waarbij ik een mirtazapine achtige verbinding moet bepalen met een gebufferde mobiele fase pH 7,4. Visueel gezien lijkt er op basis van mijn chromatogrammen geen spraken van overbelading / meten buiten het lineair dynamisch bereik van mijn detector. Toch gaat mijn 1e orde regressielijn niet door 0 (omsluit 95% BI niet) en ook uit de residual plot blijkt dat er spraken is van een 2e orde model. De ijklijn vlakt over de range van 10 tot 150% niet af. De eerste levels liggen onder de lijn, daarna liggen mijn punten boven de lijn en de laatste levels liggen weer onder de lijn. Het product heeft een UV maximum van 200 nm. De methode meet op de helling van het UV spectrum bij 220 nm. Ook in het lage gebied van 0,05 tot 1% is het verband niet lineair, maar polynomial. Kan dit beeld veroorzaakt worden door kolom interacties? (ik gebruike en base deactivated silica kolom) Is het verschijnsel product gerelateerd of hangt het samen met mijn detectie? Wie kan me uitleggen wat ik hier waarneem. Kom er zelf en met fabrikanten niet uit.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Jooken

    Jooken


  • >250 berichten
  • 677 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 november 2011 - 20:10

Kan je de concentraties / piekoppervlakten opgeven?
Eventueel ook de rest van de methode: kolomafmetingen, debiet, mobiele fase samenstelling.
Heb je ook eens een blanco geÔnjecteerd?

Veranderd door Jooken, 07 november 2011 - 20:12


#3

Skydiver32

    Skydiver32


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 november 2011 - 20:18

De blanco's bevatten een kleine piek die onder de hoofdpiek valt, de bijdrage van deze piek is echter verwaarloosbaar en in verhouding overal even groot (constant niveau in 10 blanco's). de mobiele fase is 400 ACN:100 fosfaatbuffer pH 7,5:500 MeOH. Concentratie van mijn oplossing is 20 mg/25ml (100%) niveau en dus 0,2 mg/25 ml op 1% niveau. De kolom is een 25 cm, 4.6 mm, 5um deeltjes base deactivated silica kolom. Areas liggen rond de 8000 mAU*S op 100% niveau en 79 mAU*S op 1% niveau. De flow is 1,0 ml/min

Veranderd door Skydiver32, 07 november 2011 - 20:19


#4

Jooken

    Jooken


  • >250 berichten
  • 677 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 november 2011 - 21:14

Er is in elk geval niets mis met de keuze van de kolom of de mobiele fase. In principe moet dat werken.

Wat ik zo voor de vuist kan bedenken: de concentratie van je analyt is vrij hoog: 20 mg/25 mL is 800 ppm, maar anderzijds is de curve bljkbaar ook niet lineair in het lage concentratiegebied. Ikzelf heb al ijkcurven gezien die maar lineair waren tot ca. 4 ppm

Zorg ervoor dat de buffercapaciteit groot genoeg is: De fosfaatbuffer in de waterige eluent component moet min. 20 mM (en liefst niet hoger dan 50 mM) zijn. Zijn de retentietijden voldoende reproduceerbaar?

Zorg ervoor dat de absorbantie bij het piekmaximum zeker niet boven 1 gaat (en bij voorkeur niet hoger dan 0,8)

Ter illustratie, ťťn van mijn ijkcurven: de eerste is genomen over een breed concentratiegebied (0 tot 21 ppm) ; het verband lijkt kwadratisch te zijn:
Geplaatste afbeelding

Als we het concentratiegebied beperken van 0 tot 4 ppm, is de curve wel degelijk lineair:
Geplaatste afbeelding

Mijn ervaring is ook dat de precisie kan verhoogd worden door oplossingen gravimetrisch te maken: In plaats van 1 mL te pipetteren, WEEG hoeveel je precies hebt toegevoegd.

#5

Skydiver32

    Skydiver32


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 november 2011 - 22:59

De absorbantie bij het UV maximum (200 nm) gaat zeker over de 1. We zien dit o.a. terug als we UV piek purity bepalen. We meten echter bij 220 nm en hier blijven we wel onder de 1. Zelf heb ik het idee dat hier mogelijk de oorzaak gezocht moet worden, maar ik kan hier in literatuur geen direct antwoord op vinden. Jooken, kan jij mij hier mogelijk meer over vertellen?

#6

Jooken

    Jooken


  • >250 berichten
  • 677 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 november 2011 - 16:18

Als ik jou was zou ik eens kritisch naar de chromatogrammen kijken:
- is de top van de piek mooi scherp? (geen "sigaar" of "vierkante"-top)
- Allicht kan je een overlay doen van chromatogrammen van verschillende concentraties. Kijk eens of de piekvorm niet verandert. Je kan dit zeer makkelijk zien door het chromatogram met de laagte conc te vermenigvuldigen met een factor zodat de piek evenhoog is als de hoogste conc.
- wordt de intergratie altijd op een consequente wijze door de software berekend?
- Zit er niet teveel ruis op het chromatogram?

Verder is dit geen evident probleem (anders had je de oplossing al zelf gevonden), dus vanalles proberen is de boodschap.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures