Springen naar inhoud

qPCR interne controle zwak, echter ...


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 13 april 2012 - 07:56

Hallo iedereen,

Momenteel ben ik bezig met het detecteren (en genotyperen) van het Humaan Papilloma Virus (HPV) in tumoren. Dit doet ik met behulp van een multiplex qPCR met het Taqman principe, waarbij gebruik wordt gemaakt van genomisch DNA (géén RNA). Het DNA is verkregen door het gebruik van de QIAamp DNA kit, heeft een A260/280 van 1.79 en er is 25 ng DNA gebruikt per PCR reactie. Vanwege geheimhouding kan ik maar beperkte informatie geven betreft de techniek zelf, so bear with me.

We hebben een vijftal kanalen (voor nu resp. A, B, C etc. genoemd) en een vijftal primer/probe mixen die elke 4/5 verschillend gelabelde probes bevat en 4/5 primer sets voor het specifiek detecteren van een HPV type (mixen worden resp. 1, 2, 3 etc. geneomd). In kanaal A meet je enkel de fluorescentie van de probe, behorende bij de interne controle (beta-globine). Zie figuur 1.

Figuur 1: Een vereenvoudigd genotypering schema waarbij de betreffende kanalen en multiplex primer/probe mixen zijn weergegeven.
Geplaatste afbeelding

Ik heb één sample waarbij alle beta-globine controles nagenoeg negatief tot zwak eruit zien, waardoor we dus zouden denken dat de DNA input niet in orde is... en de kans op een vals-negatieve HPV uitslag groter is (zie figuur 2). Echter zie ik dat er in mix 3 bij kanaal D toch een positieve uitslag komt met een Cp-waarde van 30,96 (zie figuur 3).

Figuur 2: Amplificatie curves van het sample (zwart), de negatieve (rood) en positieve (groen) controles van alle mixen gemeten bij kanaal A.
Geplaatste afbeelding

Figuur 3: Amplificatie curves van het sample (zwart), de negatieve (rood) en positieve (groen) controles van mix 3 gemeten bij kanaal D.
Geplaatste afbeelding

De negatieve controles en de positieve controles die mee zijn genomen in de run voor elke mix zijn overigens allen in orde.

Overigens kan er geen sprake zijn van kruiscontaminatie met DNA van een ander sample, aangezien het HPV type dat bij dit sample gedetecteerd is nog niet is gevonden in andere samples.

Wie herkent die probleem en/of heeft hier een verklaring voor?

Veranderd door Callisto, 13 april 2012 - 07:59


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 13 april 2012 - 13:25

Ik zal zeggen herhalen. Je zegt zelf dat er geen cross contiminatie kan zijn en alle controles goed zijn.
Nog even het DNA checken op kwaliteit en dan nogmaals runnen met een negatieve en een positieve controle.
Misschien ook nog een paar samples meenemen uit de serie die in de buurt liggen om een zekerheid in te brengen. Ik denk dat een nieuwe run meer duidelijkheid geeft ipv een oorzaak zoeken.
Als je housekeeping gene(beta-globline) niet goed heeft gewerkt moet je hem zo ie zo herhalen.

Misschien besmetting vanuit de lucht. Is mogelijk, goede duidelijke pre en post pcr ruimtes op het werk?

MvG Ron

#3

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 17 april 2012 - 08:32

Toen ik deze topic aanmaakte had ik de test al herhaald. De resultaten zijn reproduceerbaar.

Het DNA is van voldoende kwaliteit (A260/280 = 1.79).

En we houden pre- en post-PCR strikt gescheiden inderdaad.

Veranderd door Callisto, 17 april 2012 - 08:33


#4

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 31 mei 2012 - 10:25

Inmiddels is dit probleem opgelost door het DNA te testen met behulp van een Real-Time ladder PCR. Hierbij werden er PCR producten geproduceerd van verschillende groottes, waardoor er een uitspraak kon worden gedaan over de fragmentatie van het DNA (het fragmenteren van DNA is een bekend probleem bij het gebruik van DNA samples uit formaline gefixeerde weefsels).

Het PCR product voor de beta-globine controle was groter dan het PCR product van het betreffende HPV type wat gedetecteerd is in dit sample en viel net buiten de grootte van PCR producten die geproduceerd kunnen worden met dit DNA sample.

#5

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 31 mei 2012 - 13:37

Het klopt inderdaad dat er een grote kans is dat DNA fragmenteerd als je het isoleert uit formaline gefixeerde weefsels. Daarom is weefsels opslaan in vloeibare stikstof een beter idee.
Maar mooi dat je het hebt opgelost.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures