Springen naar inhoud

PCR-techniek



  • Log in om te kunnen reageren

#1

Cura

    Cura


  • >1k berichten
  • 2956 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 04 september 2012 - 17:27

Ben bezig met een casus rondom genetica en de PCR-techniek, en kom informatie tegen over de werkwijze tijdens een PCR-analyse, waar ik wat vragen over heb:

Als de temperatuur te laag is vormt het DNA dubbelstrengen.

(Bron, 2e dia)

Tijdens welke stap moet deze temperatuur niet teveel zakken?

De eerste stap bestaat uit het denatureren, verhitting tot 95 graden Celcius. Dan komen de beide helixen dus los van elkaar. De weergegeven zin geeft echter de interpretatie dat de strengen niet aan elkaar moeten gaan (en juist los van elkaar zijn geraakt), dus zijn we al verder in het proces dan stap 1....vermoed ik.

De tweede stap bestaat uit het verlagen (65 graden Celcius) van de temperatuur...dus betekent het dan dat de temperatuur niet verder moet dalen, en dat 65 graden dus de min. temperatuur is, omdat anders de waterstofbruggen tussen de helixen worden hersteld?

En de derde stap bestaat weer uit het verhogen (72 graden Celcius) van de temperatuur...maar het lijkt me sterk dat de zin hier op slaat.

En de vraag die hierbij ook opkwam: Hoe kan het dat, als de temperatuur te laag wordt, de helixen dan weer 'samensmelten'?

Ik zou namelijk verwachten dat bij eerdere verhitting heel veel watermoleculen verdampt zijn. Om opnieuw waterstofbruggen te vormen, die de beide helixen kunnen verbinden, heb je watermoleculen nodig....waar komen die dan vandaan? Zijn er nog genoeg overgebleven na de denaturatie?
Small opportunities are often the beginning of great enterprises. (Demosthenes, 384 BC - 322 BC)

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Typhoner

    Typhoner


  • >1k berichten
  • 2446 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 september 2012 - 18:14

En de vraag die hierbij ook opkwam: Hoe kan het dat, als de temperatuur te laag wordt, de helixen dan weer 'samensmelten'?


Dat is chemie, dat ken ik. :)

Ik zou namelijk verwachten dat bij eerdere verhitting heel veel watermoleculen verdampt zijn.

Nah, daar moet je niet aan denken. Beschouw steeds hetzelfde systeem (met dezelfde hoeveelheden deeltjes) maar alleen verschillende temperaturen. Ik bedoel, water verdampt ook op 20 °C.

Om opnieuw waterstofbruggen te vormen, die de beide helixen kunnen verbinden, heb je watermoleculen nodig....


Nee...
Geplaatste afbeelding
waar zie je water?

De reden is gelijkaardig als bij het verschil vast/vloeistof/gas (men spreekt ook van DNA smelten, dus dat is niet zo vreemd). Die waterstofbruggen hebben maar een zekere kracht, en op hogere temperaturen bewegen alle atomen sneller, waardoor de strengen zich makkelijker van elkaar kunnen "losrukken". Op lagere temperatuur kunnen de strengen, eens bij elkaar in de buurt, terug aan elkaar gaan hangen en bewegen ze niet te heftig om tegen te stribbelen.

Veranderd door Typhoner, 04 september 2012 - 18:15

This is weird as hell. I approve.

#3

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 04 september 2012 - 18:27

Met die zin bedoelen ze niets meer of minder dan dat DNA kan renatureren wanneer de temperatuur van het reactiemengsel zakt. Gelukkig maar, want bij afloop van je PCR wil je geen losse stukjes enkelstrengig DNA.

De tweede stap bestaat uit het verlagen (65 graden Celcius) van de temperatuur...dus betekent het dan dat de temperatuur niet verder moet dalen, en dat 65 graden dus de min. temperatuur is, omdat anders de waterstofbruggen tussen de helixen worden hersteld?

Als de temperatuur te hoog is kunnen de primers niet binden. Als de temperatuur te laag is, zal het DNA inderdaad renatureren of zullen de primers aspecifiek binden. Met andere woorden, ze komen niet op de plaats waar jij ze wil hebben.

Verder is het niet zo dat de minimumtemperatuur altijd 65°C is. Die is immers afhankelijk van je gekozen primers.

En de vraag die hierbij ook opkwam: Hoe kan het dat, als de temperatuur te laag wordt, de helixen dan weer 'samensmelten'?

Ik zou namelijk verwachten dat bij eerdere verhitting heel veel watermoleculen verdampt zijn. Om opnieuw waterstofbruggen te vormen, die de beide helixen kunnen verbinden, heb je watermoleculen nodig....waar komen die dan vandaan? Zijn er nog genoeg overgebleven na de denaturatie?

Waar doel je precies op? Tussen de basen zit geen water... -> Zie Typhoner

In je PCR epje echter wel, daarom werk je in praktijk altijd met gesloten epjes (max 50µL). Om het verdampen van water tegen te gaan gebruik je meestal in een toestel waarin het deksel van de epjes ook verwarmd wordt, op die manier kan geen condens ontstaan. Een alternatief is het toevoegen van een druppel minerale olie.

P.S.: Ik heb het zelf al eens meegemaakt dat m'n epje niet goed gesloten was. Het resultaat was dat alles verdampt was en er niets meer te redden viel :(.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#4

Cura

    Cura


  • >1k berichten
  • 2956 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 04 september 2012 - 19:14

Bedankt beiden voor de reactie!

Die waterstofbruggen hebben maar een zekere kracht, en op hogere temperaturen bewegen alle atomen sneller, waardoor de strengen zich makkelijker van elkaar kunnen "losrukken". Op lagere temperatuur kunnen de strengen, eens bij elkaar in de buurt, terug aan elkaar gaan hangen en bewegen ze niet te heftig om tegen te stribbelen.


Dus als ik het goed begrijp verdwijnen de waterstofbruggen niet, maar raken ze alleen van de andere helix los?

Verder is het niet zo dat de minimumtemperatuur altijd 65°C is. Die is immers afhankelijk van je gekozen primers.


Aah ok, daar was ik nog niet van op de hoogte! :)

Waar doel je precies op? Tussen de basen zit geen water... -> Zie Typhoner


Weet ik, maar wel aan het begin- en eindpunt van een waterstofbrug...ik denk/dacht dat die beide moleculen verdampen (door de temperatuursverhoging) waardoor de waterstofbrug loskoppelt en nog maar aan 1 helix zit....
Small opportunities are often the beginning of great enterprises. (Demosthenes, 384 BC - 322 BC)

#5

Typhoner

    Typhoner


  • >1k berichten
  • 2446 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 september 2012 - 19:28

Dus als ik het goed begrijp verdwijnen de waterstofbruggen niet, maar raken ze alleen van de andere helix los?


dat impliceert dat ze ook verdwijnen: als bepaalde moleculen zich op de juiste manier oriënteren, kunnen ze elkaar aantrekken. Dat heet dan een waterstofbrug (in bepaalde gevallen waarbij dus een H meespeelt). Als de moleculen (hier de strengen) te ver weg zijn van elkaar is er geen sprake van een waterstofbrug. Het kan natuurlijk wel dat de strengen elk apart met watermoleculen in de buurt waterstofbruggen gaan vormen.
This is weird as hell. I approve.






Also tagged with one or more of these keywords: biologie

0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures