Springen naar inhoud

PCR geen bandjes


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Manon Oudenampsen

    Manon Oudenampsen


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 07 juni 2013 - 20:46

Hallo,

Ik probeer mutaties die met diabetes type twee verband houden aan te tonen samen met nog een aantal anderen... De genen die we gebruiken zijn pparg, cd36, tcf7l2 en kcnj11

Nu zijn we dus bezig met de pcr, maar we krijgen geen product, bij geen enkele mutatie, in eerste instantie hadden we vervuiling, maar na pipetten schoon gemaakt te hebben, meer gebruik te maken van filtertipjes, en andere producten in de primermix (nieuw water, buffer e.d.) is de erge vervuiling weg. toen zijn we op zoek gegaan naar andere instellingen e.d. zo hebben we de annealingstemperatuur al verlaagt (van 60 dan wel 62 naar 55 graden celsius) en we hebben de magnesiumconcentratie verhoogd (van 1,5 mM naar 2,25 mM, maar de opgezuiverde producten zitten wel in TE) maar vooralsnog helpt niets. op de gellen zien we wel primers (vage band varrierend van ongeveer 75 bp tot ongeveer 12). we hebben de cycly op 40 seconden per onderdeel gezet, en we beginnen de pcr met een extra denaturatie van 94 graden en dan 5 minuten, en aan het eind hebben we een elongatie van 10 minuten bij 72 graden. We gebruiken tac polimerase, maar wel wat aan de vele kant (omdat we niet minder konden pipeteren en we het niet wilden verdunnen omdat we niet goed weten waarin we dat moeten doen en hoe stabiel het dan blijft). Er is een groot verschil in lengte van het product, van ongeveer 200 baseparen tot ongeveer 1300 baseparen, dus als het de duur van de cycli is, zouden we toch bij de kleine producten wel wat moeten zien?

Daarnaast hebben we van pparg en van tcf7l2 een protocol (inclusief primers) gekregen van een ander onderzoek, en daar is het wel gelukt...

Heeft iemand nog tips over wat we nog kunnen veranderen om toch producten te krijgen?

Groeten Manon

Veranderd door Manon Oudenampsen, 07 juni 2013 - 20:48


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 juni 2013 - 00:03

Ik denk dat je net even te simpel hebt gedacht bij de opbouw van de PCR. Je bent er vast van bewust dat de PCR 3 'stappen' heeft (soms meer): denaturation, annealing, elongation.

Wat belangrijk is, is dat je weet dat de temperatuur die je gebruikt bij je annealing stap, heel erg afhankelijk is van de sequentie van je primers. Je kunt de melting temperature ( Tm ) berekenen met verscheidene tools die op het internet beschikbaar zijn. Je gebruikt dan een annealingstemperatuur die 3-5 graden onder de Tm zit van de primer die de laagste Tm waarde heeft. Deze stap hoeft maar 20-40 seconden te duren. Hoe lager jij gaat zitten met je annealingstemperatuur, hoe aspecifieker je PCR wordt. Om die reden heb ik ook wel eens 1-2 graden onder de Tm aangehouden, wat ook heeft gewerkt. Maar ga ook niet te dicht op je Tm waarde zitten, want dan zullen je primers niet goed kunnen hechten aan je template.

Je gebruikt een taq polymerase, maar je moet weten dat niet elke taq polymerase vergelijkbaar is. Zo kan de snelheid waarmee het werkt verschillen, maar ook hoeveel 'foutjes' het polymerase kan maken. Daarom is het belangrijk om te kijken naar de datasheet/handleiding die je bij je polymerase hebt gekregen. Daarin staat hoe lang je elongatie stap moet duren, afhankelijk van de grootte van het PCR product (amplicon) wat jij wilt maken. Houdt er ook rekening mee dat, als je meer polymerase toe gaat voegen, je ook meer magnesium nodig hebt! En hoe meer magnesium je in je reactie hebt zitten, hoe aspecifieker je PCR is. De handleiding geeft ook een indicatie hoeveel μl je moet toevoegen bij hoeveel μl totaal volume. Om je 'verdunning' probleem op te lossen... kan je dus ook een groter volume van je PCR reactie gebruiken. Maar je kan ook een 'standaard' mix van je PCR componenten maken, een mastermix. Probeer de optimale concentratie aan te houden en ga niet zomaar meer toevoegen! Dit tast niet alleen je experiment aan, maar polymerase is duur. Je wilt dus ook niet meer toevoegen dan nodig is.

Je denaturatie stap kan op 98ºC voor 20-30 seconden voor je cycli. Ik raad echter anderen aan om, voordat je je cycli gaat runnen, een pre-denaturatie stap toevoegt. Hierbij ga je eerst 1 - 9 minuten (1 vind ik doorgaans genoeg) op 96ºC zitten. Dit zorgt dat je template DNA goed gedenatureerd is voordat je PCR begint.

Dat terzijde, heb ik een aantal vraagjes over een experiment. Voer je de reacties voor de verschillende genen apart uit (singleplex)? Of doe je deze in dezelfde reactie (multiplex)? Het optimaliseren van een singleplex reactie is namelijk vele malen beter te doen dan een multiplex reactie. Het geld namelijk ook... hoe meer DNA jij in je reactie hebt, hoe meer magnesium je nodig hebt (DNA 'vangt' magnesium weg, waardoor je polymerase niet goed meer werkt). Toen ik zelf mutatie onderzoek deed hield ik standaard 50 ng template DNA aan, omdat ik veel PCR product wou (maar dit kan al met veel minder).

Mijn algemene tip: Denk goed na waarom je welke stap doet, wat die stappen kunnen beinvloeden en hoe je de optimale omstandigheden kunt bepalen en hanteren. Mocht je nog vragen hebben dan hoor ik het graag!

Veranderd door Callisto, 08 juni 2013 - 00:07


#3

Manon Oudenampsen

    Manon Oudenampsen


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 08 juni 2013 - 14:42

Hallo Callisto,

Dankjewel voor je uitgebreide reactie. We hebben inderdaad wat te makkelijk gedacht met het pcr'en. In eerste instantie hebben we de tm waarde aangehouden, maar inmiddels zitten we daar dus 5 of 7 graden onder. in eerste instantie hebben we drie genen bij elkaar ingedaan die dezelfde tm hebben (nl 60) en 1 apart met een temp van 62, maar de laaste keer hebben we ze allemaal bij 55 graden gedaan. Ik heb de taq opgezocht en daar staat dat we een langere elongation tijd nodig hebben, dus we gaan de polymerase verdunnen en langer de cyclus in. en inderdaad, het maken van een mastermix is handig in ons geval. de pre-denaturatie stap hebben we ook, maar wij hebben hem bij 94 graden en dan 5 minuten. en een extension stap hebben we ook toegevoegd.

In het protocol dat we hebben gebruikt stond dat we 100 ng template dna moesten toevoegen per mix van 100 ul. echter een andere groep heeft resultaat met 10x zoveel DNA, dus 1000 ng, dat lijkt mij wel erg veel aangezien ik lees dat 100 zelfs al heel veel is, en de nanodrop bij ons gecontroleerd is en gewoon blijkt te werken.

Is het nu nog slim om de annealingstemperatuur nog lager te brengen? zeker aangezien we nog absoluut geen product zien en wel veel primers onderin.

Het verdunnen van de polymerase en verlengen van de elongationstap gaan we zeker doen, maar is het dan nodig om dat met de extra magnesium te doen of moeten we dat dan weer terugschroeven naar 1,5mM?

Omdat er zoveel dingen aangepast kunnen worden zie ik door de bomen het bos even niet meer...

#4

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 juni 2013 - 15:45

Hallo Manon,

Ik weet niet hoeveel magnesium je er nu in hebt zitten, maar 1,5 mM lijkt mij wel genoeg. Ik heb je nog niet gehoord over dNTP's, deze voeg je wel toe neem ik aan? Want anders krijg je ook geen reactie.

Primers onderin, kan er ook op wijzen dat je zogeheten primer dimeren hebt. Dit kan je voorkomen door je primers zodanig te ontwerpen dat ze niet enigszins complementair aan elkaar zijn (ook hier zijn tools voor, ik raad vooral primer-BLAST van NCBI aan).

Persoonlijk vind ik dat je wel erg laag zit met je annealingstemperatuur, ten opzichte van je meltingtemperature. Is het misschien mogelijk dat je de details naar mij op stuurt? Daarmee bedoel, primersequenties per set, hoe je PCR programma eruit ziet, welke componenten jij toevoegt in welke concentratie (en van welk merk/cat. # ze zijn). Dan kan ik je wel een beetje helpen de zaakjes op orde te krijgen.

Als ik jou was, zou ik de annealingstemperatuur juist verhogen tot 2 graden onder de laagste Tm waarde. En probeer eens de reacties singleplex uit te voeren voordat je dat multiplex doet. Dan weet je in ieder geval per reactie of ze het doen of niet, en kan je beter troubleshooten waar het aan kunnen liggen dat ze het niet doen.

Je zou het ook nog eens kunnen proberen met minder DNA, want ik denk dat die nog wel eens flink aan het magnesium vreten kan zijn. 50 ng moet echt meer dan voldoende zijn, lijkt mij. Zeker voor het enkel aantonen van een mutatie met PCR, dan heb je ook niet zoveel PCR product nodig.

Nemen jullie ook een no-template controle mee?

Veranderd door Callisto, 08 juni 2013 - 15:49


#5

Manon Oudenampsen

    Manon Oudenampsen


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 08 juni 2013 - 19:22

ik heb het even bij elkaar gezet in een wordje, hopelijk kan je er wat mee...

Bijgevoegde Bestanden


#6

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 juni 2013 - 22:34

Hallo Manon,

Dankjewel voor de informatie. Ik heb er even naar gekeken en mijn advies in een document geplaatst (zie bijlage in dit commentaar).

De tool die ik heb gebruikt om je Tm-waarden te berekenen is NCBI primer-BLAST. Hierbij heb ik aangenomen dat je je primers goed ontworpen hebt en ben ik dus niet gaan kijken of ze inderdaad wel het goede product zullen gaan vormen

Hopelijk gaat dit je helpen bij je PCR. Ik ben erg benieuwd naar je resultaten als je dit advies gaat gebruik, dus houd me alsjeblieft op de hoogte.

Groetjes

Bijlage  Advies PCR DMT2 - 1.pdf   353,47K   225 maal gedownload

#7

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 09 juni 2013 - 18:09

Als je vervolgens op zoek bent naar specifieke mutaties en je hebt een qPCR machine tot je beschikking zou je eens kunnen kijken naar HRM (http://en.wikipedia....Resolution_Melt). Er zijn ook nog andere technieken zoals molecular beacons en taqman probes beschikbaar.

Nu is er niks mis met sequencing of een RFLP. Het hangt er net allemaal maar vanaf wat je tot je beschikking hebt, hoeveel analyses je moet doen, wat voor soort mutaties je hebt te onderzoeken en hoeveel tijd je hebt.

Betreffende de PCR, je kan zeker teveel DNA toevoegen, minder in in dit geval meestal dus beter. Als een PCR totaal niet werkt dan zou een gradient PCR je iets meer kunnen vertellen over het optimum waarop je de PCR dient te doen. Mocht je a-specifieke bandjes zien dan kan een touch-down PCR nog wel eens helpen.

Veelal is het niet heel erg van belang hoe warm je de Tm hebt, hoe veel DNA je toevoegt en hoeveel magnesium in je reactie ziet. Zolang het allemaal ongeveer juist is, mits je primers goed zijn ontworpen, zal dat meestal niet zo heel veel uitmaken.
"Meep meep meep." Beaker

#8

Manon Oudenampsen

    Manon Oudenampsen


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 24 juni 2013 - 12:29

Hoi Hoi allemaal,

Wij hebben nog allemaal zaken geprobeerd, maar het is uiteindelijk niet gelukt. Nou is het andere groepen ook niet gelukt dus bestaan er ook twijfels over de stoffen die er gebruikt is dus gaat daar naar gekeken worden. Ons project is nu afgelopen dus er wordt niet verder gegaan... dit vind ik wel jammer. Maar ik vind de tips die ik heb gekregen toch erg fijn voor de volgende keer dat ik met PCR ga werken (volgend jaar in een onderzoeksgroep wat een half jaar gaat duren) omdat ik nu wel het idee heb dat ik het beter begrijp.

Dus erg bedankt, en als ik weer vragen heb dan stel ik ze wel ;)

(ow en ik had het vorige week erg druk daarom had ik nog niet weer gereageerd)

Groetej Manon

#9

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 juni 2013 - 08:18

Jammer dat het niet gelukt is, heel veel succes bij je volgende project!





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures