Springen naar inhoud

PAGE elektroforese


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Rientje

    Rientje


  • >25 berichten
  • 43 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 26 augustus 2013 - 12:57

Hallo,
ik heb een vraag waar ik het antwoord niet helemaal op weet:
Leg uit waarom bij PAGE het staal dient aangebracht te worden als een smalle zone, gewoonlijk aan de kathode kant van de gel, terwijl bij IEF het staal kan aangebracht worden zonder rekening te hoeven houden met de juiste plaats op de gel en de breedte van de staalzone.

Bij IEF dacht ik dat je toch sowieso eindigt met een smalle zone zolang het elektrischveld maar behouden wordt want dan migreren de stalen dus naar hun IEP. Maar wat gebeurd er nu precies met PAGE en waarom is de staalhoeveelheid daar beperkt bij?

Alvast bedankt!

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 26 augustus 2013 - 14:12

Bij PAGE worden eiwitten gescheiden op basis van hun moleculair gewicht. In SDS-PAGE worden alle eiwitten negatief geladen door toevoegen van SDS. Wanneer je vervolgens deze stalen bovenaan op een gel laadt en daar ook de negatieve pool aansluit, dan worden de eiwitten afgestoten en gaan ze migreren doorheen de gel. De snelheid van migratie is afhankelijk van het moleculair gewicht en de samenstelling van de gel.
Belangrijk is: hoe langer het elektrisch veld aanstaat hoe verder de stalen zullen migreren. Dit is een cruciaal verschil met IEF!

Bij IEF maakt men gebruik van een geïmmobiliseerde pH gradiënt. Vergeet hier vooral niet dat eiwitten neutraal zijn bij een pH overeenkomstig met hun iso-elektrisch punt. Wanneer een eiwit in een pH terecht komt die lager is dan zijn pI zal het geproteneerd worden en bijgevolg een positieve lading dragen. Het omgekeerde gebeurt bij een pH hoger dan de pI, dan krijgt het eiwit een negatieve lading.

Bij IEF bewegen eiwitten dus op basis van de lading die ze verkrijgen hebben door de pH in de gel. Eiwitten worden neutraal bij een pH overeenkomstig met hun pI en ondervinden daar geen effect meer van het elektrische veld waardoor ze ter plaatse blijven zitten.

Geplaatste afbeelding

Bron afbeelding: Wikipedia.nl
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#3

Rientje

    Rientje


  • >25 berichten
  • 43 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 26 augustus 2013 - 15:08

En SDS-PAGE is het aantal negatieve ladingen overeenkomstig met hun moleculair gewicht? Waarom is het bij deze techniek dan zo belangrijk dat het in een dun laagje wordt aangebracht?

#4

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 26 augustus 2013 - 17:32

Hoe groter je eiwit (en dus ook hoe groter het moleculair gewicht) hoe meer SDS eraan kan binden, en hoe meer negatieve ladingen. Hoe kleiner, hoe minder negatieve lading. Dat wil zeggen dat de verhouding van het moleculair gewicht op het aantal negatieve ladingen voor alle eiwitten, bij benadering, gelijk is aan een constante. Bijgevolg heeft dit ook geen enkel effect op de migratiesnelheid van je stalen. De bedoeling van SDS is gewoon om je stalen negatief te laden zodat ze weg migreren van de negatieve pool (de kathode).

Vervolgens speelt dus nog enkel de "grootte" van je staal een rol. Eiwitten met een hoog moleculair gewicht migreren trager door het netwerk van de gel dan eiwitten met een klein moleculair gewicht. (Dit noemt het zeefeffect.)

Waarom breng je nu een dun laagje op je SDS page aan?
Wel, zoals eerder gezegd is de bedoeling van een page om stalen te scheiden volgens hun moleculair gewicht. Vergelijk het met een loopwedstrijd. Bij de start staat 10 lopers aan de lijn en na pakweg 20 minuten kijk je wie de snelste is. Moest je nu echter loper twee en drie 1km achter de startlijn laten beginnen, dan zou je na 20 minuten misschien niet hetzelfde resultaat zien. Volg je?

Terug naar de gel nu: als daar 2 cm staal opligt zullen de moleculen in de bovenste millimeter significant achterkomen op de moleculen in de onderste millimeter. Bijgevolg krijg je een onbetrouwbaar resultaat.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#5

Rientje

    Rientje


  • >25 berichten
  • 43 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 26 augustus 2013 - 18:07

Oh oke ik snap het!

Hartelijk bedankt!

#6

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 26 augustus 2013 - 20:44

Graag gedaan!
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#7

Theo22

    Theo22


  • >25 berichten
  • 74 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 31 augustus 2013 - 07:57

Ook bij een SDS-PAGE gel kun je flinke hoeveelheden monster laden. Dat komt omdat bij SDS-PAGE electroforese de scheiding-gel vooraf gegaan wordt aan een stacking gel. Wanneer je de gel laat runnen, zullen je eiwitten zich eerst concentreren op de grens van de stacking en de scheiding-gel voordat de eigenlijke scheiding begint





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures