Springen naar inhoud

Electroforese


  • Log in om te kunnen reageren

#1

*_gast_zeeman_*

  • Gast

Geplaatst op 04 januari 2006 - 20:05

OP het internet vind je soms tweedehands betaalbare electroforese toestellen te koop.Kan iemand eens iets uitleggen,hoe electroforese eigenlijk werkt ?Iemand zei me eens iets over een gel.Is dat gel geleidend ?
Stroomwaarde ? Spanning ?Heeft het iets te maken met electrolyse ?Hoe gaat men te werk ?Het enige dat ik met zekerheid weet,is dat men met die methode de PSA waarden meet in het medisch labo.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 januari 2006 - 20:24

Electroforese is een verzamelnaam voor een aantal verschillende methoden. Men kan dit onder andere toepassen op DNA en eiwitten. Hoewel de details verschillen is het principe hetzelfde.

De standaard opstelling bestaat uit een gel (meervoud is gelen, niet gellen oid) een electrodebuffer en een spanningsbron die hierop is aangesloten.

Geplaatste afbeelding

Door een electrische stroom door de gel te laten lopen zal het monster onder invloed van zijn eigen electronegativiteit gaan lopen (runnen). De lading van het monster kan worden gevarieerd door de pH waarde van de gel te varieŽren. De bekendste vorm van electroforese is waarschijnlijk de 2-D electroforese. Deze bestaat respectievelijk uit 2 methoden; IEF (iso electric focussing) en SDS-page (Sodium Dodecyl sulfaat polyacramide gel electroforese).

Bij IEF bewegen eiwitten over een pH gradiŽnt (van pH 3 tot pH 10 of van pH 4 tot pH 7) en er wordt een electroforese uitgevoerd. Vervolgens beweegt elk eiwit over de strip, totdat de pH op de strip gelijk is met het isoelectrisch punt. De nettolading van het eiwit is in dit geval gelijk aan nul en stopt met bewegen. Deze techniek scheidt op basis van ioniseerbare restgroepen van aminozuren.

Het tweede deel betreft SDS-PAGE. PAGE staat voor polyacrylamide gel electroforese. SDS (sodium dodecyl sulfate) is een anionisch detergent dat eiwitten denatureert en polypeptiden een uniforme negatieve ladingsdichtheid geeft.
Nadat gebruik is gemaakt van isoelectric focussing wordt de pH gradiŽnt strip ondergedompeld in SDS buffer. Daarna wordt 2-mercapto-ethanol toegevoegd. Dit bevordert de denaturatie doordat de zwavelbruggen worden verbroken. SDS en 2-mercapto-ethanol hebben geen invloed op de karakteristieke eigenschappen van GFP. Daarna wordt de strip geplaatst op het randje van een SDS-PAGE sheet, waarover een voltage in de juiste hoeken van de strip wordt gezet. Onder deze omstandigheden migreren polypeptiden over de polyacrylamide gel op basis van het logaritme van hun massa. Dat betekent dat de kleinste polypeptiden het snelst bewegen in een bepaalde tijd, afhankelijk van de poriegrootte in de gel.

Als gebruik wordt gemaakt van fluorescerend gelabelde eiwitten, kunnen nieuwe gesynthetiseerde eiwitten ontdekt worden. De voltage, dat over het elektrische veld wordt gezet, is kiesbaar. Afhankelijk van de voltage zullen de polypeptiden sneller of langzamer lopen. Aangezien een beter resultaat verkregen wordt wanneer de polypeptiden niet te snel zullen lopen, wordt de voltage niet te hoog gezet. De voltage is afhankelijk van de concentratie van de gel.

De tijd van deze bepaling is dus afhankelijk van de voltage. SDS kan duizenden eiwitten uit een eiwitmix halen. SDS kan zelfs polypeptiden die qua molaire massa minder dan 10 % van elkaar verschillen, uit elkaar halen. Het kan echter geen polypeptiden met een gelijke massa scheiden. Daarom wordt gebruik gemaakt van isoelectric focussing zoals eerder beschreven. Bij de zuivering van GFP is het van belang dat de molaire massa van dit eiwit bekend is.
"Meep meep meep." Beaker

#3

kpil

    kpil


  • >25 berichten
  • 84 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 januari 2006 - 20:44

Aanvullingen

Dat betekent dat de kleinste polypeptiden het snelst bewegen in een bepaalde tijd, afhankelijk van de poriegrootte in de gel.


Polyacrylamide gelen worden gemaakt door polymerisatie van acrylamide en N,N'-methylene-bis-acrylamide. De verhouding tussen die twee bepaalt de poriegrootte.

De voltage, dat over het elektrische veld wordt gezet, is kiesbaar. Afhankelijk van de voltage zullen de polypeptiden sneller of langzamer lopen. Aangezien een beter resultaat verkregen wordt wanneer de polypeptiden niet te snel zullen lopen, wordt de voltage niet te hoog gezet.


Er moet ook rekening mee gehouden worden dat een hoger voltage meer warmteproductie in de buffer zal veroorzaken. Dit kan zowel voor gel als eiwit nadelige gevolgen hebben. Bij capillaire electroforese bestaat dit probleem niet en kunnen wel zeer hoge voltages gebruikt worden.

SDS kan zelfs polypeptiden die qua molaire massa minder dan   10 % van elkaar verschillen, uit elkaar halen.

Wat in feite geen zo'n denderend resultaat is. Daarom wordt SDS PAGE meestal niet gebruikt om kleine verschillen op te merken.

Betere scheiding wordt behaald met andere technieken zoals RP-HPLC

#4

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 januari 2006 - 00:52

SDS-page opzich is niet afdoende daarom is het dus ook noodzakelijk om een IEF uit te voeren. Natuurlijk is dit met andere methoden te combineren zoals het gebruik van verschillende kolommen; een HIC kolom bijvoorbeeld.
"Meep meep meep." Beaker

#5

hzeil

    hzeil


  • >1k berichten
  • 1379 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 januari 2006 - 16:49

De vraag van Zeeman over wat nu eigenlijk electroforese is, is hierboven nog niet beantwoord. Aan al deze details moet voorafgaan een definitie van electroforese als een electrokinetisch verschijnsel.
Welnu, een geladen vast deeltje in een vloeistof (eventueel een eiwit) krijgt onder invloed van een electrisch veld in die vloeistof, een eenparige snelheid v die beschreven kan worden met de viscositeitswet van Stokes.

Echter, dit deeltje is omgeven door een vloeistof die tegengesteld geladen is en onder invloed van dit electrische veld in tegengestelde richting gaat bewegen. Dit samen leidt tot de bewegingsvergelijking van Helmholtz-Smoluchowski die je elders op internet kunt vinden.

Belangrijk hierbij is dat die eenparige beweging niet evenredig is met de lading van het deeltje maar met de wandpotentiaal. Die noemen we daarom ook de electrokinetische potentiaal. In de formules aangegeven als zeta of ksi (griekse letters)
Het woord electrokinetisch heeft dus betrekking op de onderling beweging van vaste wand en een vloeistof (lees: water). Er is hier geen sprake van een (electrochemische) reactiekinetiek en en het het hoort daardoor ook eigenlijk thuis bij de klassieke natuurkunde. H. Zeilmaker
Uitleggen is beter dan verwijzen naar een website





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures