Onlangs voerde ik een Western blot uit en na de eiwit specifieke detectie wou ik nog eens het het volledige PVDF membraan kleuren met Coomassie.
Ik had het al een paar keer eerder gedaan en alles verliep zonder problemen. Echter vroeg ik mij plots af waarom bij de destaining het membraan terug "wit" werd terwijl de eiwitbanden perfect zichtbaar bleven. Normaal gezien was je de overtollige Coomassie weg en blijft de eiwit gebonden kleurstof aanwezig. Echter wordt het membraan gedurende een Western wel volledig geblokkeerd met een melkoplossing. In principe is er dus overal eiwit aanwezig….
Wanneer je de Coomassie-oplossing toevoegt kleurt het membraan wel volledig blauw. Dit komt dus overeen met de verwachtingen, namelijk dat het volledige membraan bezet is met eiwitten, hetzij met melkeiwitten hetzij met eiwitten uit jouw sample.
Wanneer je na enkele minuten de destaining solution (10% azijnzuur, 40% methanol) toevoegt verdwijnt langzaam de blauwe achtergrondkleur van het membraan.
Er zijn twee mogelijke verklaringen denk ik:
- De Coomassie-melk interactie wast gemakkelijker weg dan de Coomassie-sample interacties. Persoonlijk lijkt me dat héél sterk. Waarom zou Coomassie plots specifieke bindingsvoorkeuren krijgen? Dat zou dan ook betekenen dat je nooit caseïne zou kunnen bepalen. Nogmaals, hier geloof ik niet echt in.
- Je zou kunnen zeggen dat bij het blokkeren iedere positie op het membraan bezet wordt door 1 melkeiwit. Dit in tegenstelling met de eiwitten uit je sample die in pakweg duizendvoud aanwezig zijn. Bijgevolg zou je één laagje eiwit kunnen wegwassen waardoor de achtergrond verdwijnt en toch de eiwitbanden zichtbaar blijven. Persoonlijk lijkt me dit een stuk plausibeler. Je zou dan ook verwachten dat na oneindig destainen je membraan terug wit is. Anderzijds kan je gerust destainen over het weekend zonder dat je eiwitbanden verloren gaat.
