Springen naar inhoud

SOE pcr


  • Log in om te kunnen reageren

#1

mrlngtng

    mrlngtng


  • >250 berichten
  • 251 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 december 2013 - 18:07

Hallo allemaal,

Ik snap iets niet goed aan de SOE (splicing by overlap extension) pcr.

Na een eerste PCR reactie, waarbij aan de 5' van de primers een staart wordt gekozen, krijgt men onder andere twee fragmenten, die aan de 5' kant een complementaire staart vertonen.

Deze twee fragmenten kunnen dus basenparen, maar dan moet een volledige ds DNA gemaakt worden met behulp van DNA polymerase. Aangezien deze in de 5'-->3' richting werkt, gaat dit volgens mij nog niet in deze stap, maar moet eerst nog een PCR optreden waarbij de twee speciale fragmenten met hun staart gekopieerd worden, zodat er nu dus ook twee fragmenten zijn met aan hun 3' kant een complementaire staart. Deze kunnen basenparen, DNA polymerase kan dan nucleotiden inbouwen en deze dubbelstreng kan dan geamplificeerd worden met een laatste PCR.

Nochtans vind ik overal dat je maar 1 PCR nodig hebt, dus dat het gedeelte dat ik in het rood heb aangeduid niet moet gebeuren. Kan iemand mij dit uitleggen?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 21 december 2013 - 10:07

Ik snap niet precies waarom dat niet zou lukken.

Geplaatste afbeelding
(Bron: http://openwetware.o...erlap_Extension)

Bij de Overlap-PCR kan je toch je primer designen tegen de restrictiesite (blauw) en dan gaat het polymerase toch over alles heen?

Finaal doe je wel best nog een extra (3de) PCR om alle fragmenten van restrictiesite tot restrictiesite te amplificeren zodat je het juiste fragment op gel kan isoleren.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#3

mrlngtng

    mrlngtng


  • >250 berichten
  • 251 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 december 2013 - 10:32

Ik snap niet precies waarom dat niet zou lukken.

Geplaatste afbeelding
(Bron: http://openwetware.o...erlap_Extension)

Bij de Overlap-PCR kan je toch je primer designen tegen de restrictiesite (blauw) en dan gaat het polymerase toch over alles heen?

Finaal doe je wel best nog een extra (3de) PCR om alle fragmenten van restrictiesite tot restrictiesite te amplificeren zodat je het juiste fragment op gel kan isoleren.


Ik ging er vanuit dat de eerste PCR maar uit 1 cyclus bestond, maar uiteraard gaat het hier om een 30tal cycli. In dat geval is er dus ook een complementaire staart aan de 3' kant en is mijn probleem opgelost!

Bedankt





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures