Springen naar inhoud

Restrictie enzymen



  • Log in om te kunnen reageren

#1

PWSjeni

    PWSjeni


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 12 januari 2014 - 19:40

Hallo,
Ik ben op zoek naar informatie over de werking van restrictie enzymen (en dan vooral chemisch gezien) en DNA-ligase , zouden jullie mij hierbij kunnen helpen?
Groet

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 13 januari 2014 - 14:57

Natuurlijk willen we jou daar bij helpen, maar wat je hier vraag komt zo ongeveer neer op het schrijven van een boek. Wat heb je zelf al gevonden? En tegen welke problemen stoot je precies aan?
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#3

PWSjeni

    PWSjeni


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 13 januari 2014 - 15:15

Fijn! Ow... ik had al gevonden dat er een hydrolyse plaatsvindt door de restrictie enzymen, maar ik kan geen reactievergelijking hiervan vinden. Ligase kan vervolgens deze verbinding weer herstellen (ook hier vind ik geen reactie van:P) en kan dus twee DNA fragmenten aan elkaar plakken als ze dezelfde "sticky ends" hebben. Ik weet niet of het bekend is, maar als dat zo is zou ik ook graag een beetje informatie willen hebben over hoe de enzymen hechten aan de DNA-streng (ook dit heb ik nog niet kunnen vinden). Ik weet niet of ik verder nog iets belangrijks mis, maar het is (weer) voor mijn PWS en dit moet te begrijpen zijn voor leerlingen van VWO6 die er geen literatuuronderzoek naar gedaan hebben, dus het moet niet al te ingewikkeld zijn :oops:

#4

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 14 januari 2014 - 11:11

Fijn! Ow... ik had al gevonden dat er een hydrolyse plaatsvindt door de restrictie enzymen, maar ik kan geen reactievergelijking hiervan vinden. Ligase kan vervolgens deze verbinding weer herstellen (ook hier vind ik geen reactie van:P) en kan dus twee DNA fragmenten aan elkaar plakken als ze dezelfde "sticky ends" hebben.

Eigenlijk is het vrij lastig om daar reactievergelijking op te plakken. Via deze link zie je een paar reactievergelijkingen van het mechanisme van de hydrolyse. Het eerste mechanisme is misschien het meest logische, terwijl het tweede je waarschijnlijk te ver zal leiden. In beide mechanismen komt het er op neer dat er een nucleofiele aanval (zie de lessen organische chemie ;) ) gebeurt op de fosfaatgroep van de DNA streng.

Een tweede belangrijk punt is dat restrictie-enzymen gebruik maken van bivalente ionen (X2+), meestal Mg2+. Dat magnesium is nodig om bepaalde groepen te stabiliseren en in de juiste richting te oriënteren.

Het mechanisme voor de ligatie (3 stappen) is eigenlijk nog ingewikkelder. Begrijp je hier iets van? Als je niet in detail wil treden zou je gewoon kunnen zeggen dat het 3'OH eind en het 5'P eind aan elkaar worden gezet door een ligase met het gebruik van ATP.


Ik weet niet of het bekend is, maar als dat zo is zou ik ook graag een beetje informatie willen hebben over hoe de enzymen hechten aan de DNA-streng (ook dit heb ik nog niet kunnen vinden).

Simpel gezegd herkent het enzym zijn target sequentie dankzij een complementair gedeelte dat interacties kan aangaan met de targetsite. Hierdoor wordt lokaal een zwakke 'binding' gecreëerd waardoor het enzym blijft plakken.

dus het moet niet al te ingewikkeld zijn :oops:

Ik heb geprobeerd, maar het is mislukt denk ik :P.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#5

PWSjeni

    PWSjeni


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 17 januari 2014 - 19:53

Sorry voor mijn late reactie. Ben een tijdje niet in staat geweest om te reageren vanwege de proefwerkweek.
Dat van die ionen had ik ook ergens gelezen, maar ik begreep nog niet helemaal waar die voor nodig waren.
Dat van ligatie snap ik ook wel deels. Ik denk dat ik dat ook wel op VWO6 niveau kan uitleggen. Het is niet zozeer dat het geen details mag bevatten, het moet gewoon begrijpelijk zijn, met veel uitleg enzo. (dat was misschien niet helemaal duidelijk in het vorige bericht)
Opnieuw, bedankt!

#6

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 18 januari 2014 - 10:09

Ok, succes!

Als je nog vragen hebt weet je ons wel te vinden ;).
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#7

PWSjeni

    PWSjeni


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 22 januari 2014 - 19:10

Ik heb nog een vraagje, zijn er voor DNA-ligase ook specifieke cofactoren? Zoals Mg2+ bij restrictie-enzymen? Ik heb verschillende dingen voorbij zien komen, zoals NAD+, Mg2+, ATP.

Daarnaast vroeg ik me nog iets af. Klopt het dat bij recombinant DNA-techniek het gen eerst geïsoleerd en geknipt wordt, vervolgens het specifieke gen geselecteerd dmv elektroforese, dit vermeerderd wordt door PCR en het dan via ligatie ingebouwd wordt in een ander stuk DNA? Of ben ik nu complete onzin aan het opschrijven?:P

#8

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 24 januari 2014 - 16:13

Wat je eerste vraag betreft vond ik dit:

There are two classes of DNA ligases. The first uses NAD+ as a cofactor and only found in bacteria. The second uses ATP as a cofactor and found in eukaryotes, viruses and bacteriophages.

Bron: http://www.biochem.u...NA%20Ligase.htm

Dit wordt ook bevestigd in verschillende artikels [1][2]

Hetzelfde geldt voor de vereiste van Mg2+, voor een optimale werking van het ligase is magnesium vereist. [3]


Daarnaast vroeg ik me nog iets af. Klopt het dat bij recombinant DNA-techniek het gen eerst geïsoleerd en geknipt wordt, vervolgens het specifieke gen geselecteerd dmv elektroforese, dit vermeerderd wordt door PCR en het dan via ligatie ingebouwd wordt in een ander stuk DNA? Of ben ik nu complete onzin aan het opschrijven? :P

Het is zeker geen onzin, en het kan op deze manier gedaan worden, maar het zal niet zoveel gedaan worden ;).

Het 'probleem' van jouw methode is dat je moeilijk een restrictie-enzym zal vinden dat enkel voor en na jouw gen van interesse knipt. In praktijk zal het eerder het volledige genoom verknippen en krijg je duizenden/miljoenen stukjes DNA. Wanneer je dat gaat scheiden op gel is het onmogelijk om daar net jouw stukje uit te kiezen. Beter is om rechtstreeks te proberen om jouw gen van interesse te PCRen vanaf het DNA. Kies gepaste primers (specifiek voor jouw gen) en dan krijgt meteen een aanrijking van jouw gewenste stukje. Nadien kan je dat mengsel nog scheiden op gel (agarose geleketroforese), je zal dan een band zien voor je genomisch DNA en een enorm heldere band van jouw gen van interesse. De enorme heldere band van jouw stukje DNA komt doordat er een gigantische hoeveelheid van dat stuk aanwezig is, je hebt het immers geamplificeerd.

Toch zijn daar een paar problemen mee:
  • Zoals je wel weet bevatten genen van eukaryote cellen exons en introns. Als je een gen met introns naar een ander organism wil transfereren zal dat vaak aanleiding geven tot problemen. Stel dat je bijv. een menselijk eiwit met een of ander therapeutisch belang wil produceren in de bacterie E. coli (omdat bacteriën snel groeien en je dus snel veel kan produceren). Alle prokaryoten en dus ook bacteriën hebben geen aangepaste machinerie om die introns weg te splicen. Bijgevolg zal je dat eiwit, met therapeutisch belang, nooit tot expressie komen :(.

    Het is daarom beter om te vertrekken van cDNA (copy DNA) dat enkel de coderende sequentie bevat. Dat kan je eigenlijk heel eenvoudig bekomen. Zoals je ook wel weet bevat het finale mRNA, dat aanleiding geeft tot eiwitten, geen introns meer. Als je dat nu kan omzetten tot DNA (wat je gebruikt bij het klonen) sta je al een hele stap verder.
    In praktijk kan je dat heel eenvoudig doen door eerst al het mRNA uit de cel op te zuiveren. (Daar bestaan héél eenvoudig kits voor, geloof me echt kinderspel.) Vervolgens zet je al dat mRNA om naar cDNA via een RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR). Reverse transcriptase is een enzym dat RNA omzet in DNA, vanwaar het komt moet je maar eens opzoeken.
    Na die RT-PCR heb je dus cDNA van alle coderende genen en moet je dus nog enkel jouw gen van interesse kiezen. Hoe doe je dat? Via PCR met specifieke primers. Om te controleren of je PCR geslaagd is kan je het resultaat op gel zetten en kijken als je een bandje ziet bij de gewenste grootte.
  • Ok, punt 2. Als je DNA in een gel wil visualiseren gebruik je ethidium bromide in combinatie met UV licht of heden ten dage andere veiligere moleculen (bijv. Sybr Safe). Niettegenstaande intercaleren deze moleculen tussen het DNA en zijn ze absoluut mutageen. Je kan dus NOOIT garanderen dat het stukje DNA dat je uit de gel haalt nog precies hetzelfde is als wat je erin hebt gestoken. Precies daarom zal je ook nooit alle materiaal op gel zetten, enkel maar een paar µL die je gebruikt om te controleren of je reactie gelukt is. Als je reactie gelukt is weet je immers dat er in je epje een gigantische hoeveelheid van dat stukje DNA aanwezig is.

Voila, nu heb je dus de coderende sequentie van jouw gen van interesse in handen. De volgende stap is om dat in een vector te plakken waarmee je het therapeutisch eiwit kan produceren ;).

Ter info: dat plakken kan je doen door stukjes aan elkaar te ligeren, maar tegenwoordig bestaan er veel snellere alternatieven zoals bijv. de Gateway® technologie of TOPO® klonering. Maar over kloneringsmethoden kan je nog een apart boek schrijven.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#9

PWSjeni

    PWSjeni


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 24 januari 2014 - 18:57

Super, dit is precies wat ik nodig had! Bedankt!:)






Also tagged with one or more of these keywords: scheikunde

0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures