Springen naar inhoud

Berekening voor digestie en ligatie


  • Log in om te kunnen reageren

#1

mieke011

    mieke011


  • 0 - 25 berichten
  • 14 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2014 - 10:22

Hallo,

Ik weet dat hierover veel geschreven is op internet en ook op dit forum. Maar toch kom ik er niet uit.

Voor een experiment moet er plasmide (4102 bp) en PCR product (746 bp) gedigesteerd en geligeerd worden.

Voor een digestie reactie heb ik gevonden dat er maximaal 1ug tot 5-10 ug plasmide mag worden toegevoegd (wat ik nogal een groot verschil vind). Voor een PCR product 50ug (?).

Echter heb ik ook gelezen dat er bij de ligatie 500 ng plasmide moet worden toegevoegd en 1500 ng PCR product (dus 1:3).

Ik zat voor de digestie aan de volgende hoeveelheden qua mix te denken (voor een dubbel digestie):

DNA
xxx
Buffer (10x)
2 µl
Enzyme 1 (10U/µl)
1 µl
Enzyme 2 (10U/µl)
1 µl
H2O
tot 20 µl

Voor de ligatie het volgende:
Plasmide 500ng
xxx
PCR product 1500ng
Xxx
Ligase
1 ul
Buffer
1 ul
MilliQ
Tot 20 ul


Maar hoe moet ik de berekening maken dat ik genoeg plasmide/PCR product voor mijn ligatie heb tijdens de digestie? (dus hoe zorg ik dat ik minimaal 500 ng plasmide en 1500 ng PCR product heb tijdens mijn digestie, zodat ik hiervan x ul kan nemen en voor de ligatie kan gebruiken)


Hopelijk kan iemand mij helpen.

Groeten,
Mieke

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Theo22

    Theo22


  • >25 berichten
  • 74 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 22 februari 2014 - 00:46

Voor een ligatie gebruik je vaak de verhouding vector:insert = 1:3 tot 1:10, afhankelijk van hoe makkelijk de ligatie zal gaan. Let op, je hebt het dan wel over moleculen! Jij gaat in jouw voorbeeld uit van een verhouding van 1:3 (plasmide: PCR product), maar dan wel in ng. Je houdt helemaal geen rekening met het lengte verschil tussen vector en insert.

Bovendien mis ik tussen de digestie en de ligatie een opzuiverings stap. De concentratie na opzuivering bepaald mede het aantal ul wat je van insert en vector gaat ligeren.
Probeer maar eens een nieuw protocol op te stellen.

#3

Jaffaa

    Jaffaa


  • >25 berichten
  • 83 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 februari 2014 - 05:09

Tevens zou ik het volume van de Ligatie zo klein mogelijk houden, dus eerst alle volumes berekenen van de ligatie mix en dan een klein beetje MQ toevoegen. dus dan kan het zijn dat het eindvolume 15ul word oid. dit zou ik doen om de kans te vergroten dat een insert de vector vind, om het maar even zo te zeggen, een Ligatie blijft vaak een lastig iets.

Zoals Theo al aangeeft is een zuivering stap na digestie belangrijk om de enzymen kwijt te raken! hiervoor zijn genoeg kits beschikbaar of een phenol/chloroform zuivering is ook mogelijk. wees wel voorzichtig met het PCR product, dit raak je heel snel kwijt. In het verleden heb ik bij kleinere pcr producten ook gekozen om deze niet te zuiveren na digestie en deze gelijk te gebruiken in de ligatie, dit geen problemen.

greets





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures