Springen naar inhoud

Basenparen tellen in een restrictie analyse



  • Log in om te kunnen reageren

#1

Matthijs2504

    Matthijs2504


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 19 februari 2014 - 02:46

Hallo,

Ik studeer bio-informatica en om een beetje een beeld te krijgen van de plek waar onze informatie vandaan komt, zijn we op het lab gedropt om een restrictie-analyse uit te voeren. Op zich wel leuk, maar bij labwerk hoort natuurlijk ook een logboek waarin onder andere de resultaten naar voren komen. Mijn probleem is eigenlijk dat ik niet echt weet hoe ik het resultaat moet lezen.

Wat informatie over de opzet van het practicum (uit de handleiding):

“Tijdens dit practicum gaan we een plasmide (pUC18) uit E. coli isoleren, dit plasmide behandelen we met bepaalde restrictie-enzymen (DraI, HaeII en BAMHI) en daarna wordt door middel van gelelectroforese de lengte van de DNA fragmenten bepaald. Met behulp van de DNA lengte en fragment volgorde kunnen we een restrictiekaart maken van het geïsoleerde plasmide (pUC18). Om de DNA lengte te kunnen bepalen (de lengte wordt weergeven in het aantal basenparen) gebruiken we een DNA standaard (DNA fragmenten met een bekende lengte) die meeloopt op de gel.

Naast deze experimentele handelingen wordt ook via het computerprogramma Neb cutter de pUC18 met dezelfde restrictie-enzymen geknipt. Dit ter controle voor je eigen experimentele restrictie. In tabel 1 (bladzijde 16) kan je al je resultaten (experimenteel en via Neb cutter) overzichtelijk noteren.”


Ik heb een foto gemaakt van mijn resultaat (sorry voor de kwaliteit, maar ik hoop dat het enigszins zichtbaar is):

restrictiefoto.png

Helemaal rechts is de marker te zien en aan de hand daarvan moet de grootte gemeten worden. Zover ik weet zijn de felle bandjes op een log2-marker 500, 1000 en 3000 bp, maar ik kan dat amper aflezen uit mijn resultaat aangezien alles fel is. Moet ik gewoon onderaan beginnen bij de marker (wat dan 100bp is neem ik aan) en vervolgens kijken op welke hoogte de andere bandjes ongeveer staan?

De gelelektroforese (1.5% agarose) heeft ongeveer 90 minuten geduurd. Alle 'grote' stukken gaan langzamer, verklaart dat waarom alle bandjes zich nog bovenin bevinden of is 90 minuten gewoon erg weinig voor een restrictie-analyse?

Veranderd door Matthijs2504, 19 februari 2014 - 02:47


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 19 februari 2014 - 19:28

Uitstekende keuze bio-informatica. Het is niks voor mij, maar er is een enorme nood aan!

Wat de gel betreft, de foto is inderdaad niet zo uitstekend...je mist een nogal groot gebied onderaan waar bijv. de bandjes in laan 5 zomaar in verdwijnen.

Alle fragmenten die in de log2 marker zitten kan je hier vinden. Ik zou sowieso niet onderaan beginnen met tellen, die gebieden zijn misschien van de gel gelopen of zie je minder goed. Baseer je voornamelijk op de heldere spots en laat die overeenkomen met de heldere banden uit bovenstaande pdf. Probeer op die manier ieder zichtbaar bandje aan een aantal bp toe te kennen.

Wat het resultaat betreft: volgens mij ziet dat er niet zo goed uit ;). Bij DraI, HaeII en BamHI zie je bandjes op precies dezelfde hoogte. Zoiets is zeer onwaarschijnlijk, het zou al zeer toevallig moeten zijn dat drie verschillende restrictie enzymen aanleidingen geven tot fragmenten van dezelfde lengte. In NEBcutter kan je gemakkelijk de verwachte lengtes van de verschillende fragmenten berekenen. Als je dat op gel zet zou het er anders moeten uitzien.

Met je merker gaat ook iets fout, die begint véél te laag in de gel. Het is wel normaal dat de bovenste bandjes van de merker dicht bij elkaar liggen. Dit zijn immers de grote/lange stukken DNA en die scheiden iets moeilijker (in dit soort gel) in vergelijking met kleinere fragmenten.

Was dit een eendaags practicum of kan je het nog eens gaan proberen? Het is normaal dat zoiets niet onmiddellijk goed gaat, restrictie-enzymen zijn zeer gevoelige dingen en je hebt er vaak maar een µL van nodig. Als je niet veel ervaring hebt in het lab ziet alles er als een druppeltje water. Er zijn veel mensen die volledige dagen met restrictie-enzymen kloneren tegen een heel lage succes rate. Wees dus niet al te teleurgesteld als het niet onmiddellijk lukt.

De gelelektroforese (1.5% agarose) heeft ongeveer 90 minuten geduurd. Alle 'grote' stukken gaan langzamer, verklaart dat waarom alle bandjes zich nog bovenin bevinden of is 90 minuten gewoon erg weinig voor een restrictie-analyse?

Dat kan je niet zeggen. Het voltage is hierin ook van belang. Als je de grote stukken beter wil scheiden moet je overschakelen op een gel met een lager percentage agarose. Niettegenstaande is 90 minuten een gewone tijd, daar zou ik me geen zorgen over maken.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#3

Matthijs2504

    Matthijs2504


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 19 februari 2014 - 23:35

Bedankt voor je reactie!

Het was een eendaags practicum, inderdaad. Puur om een idee te krijgen van de werkzaamheden op het lab. Overigens was de docent redelijk content met dit resultaat, met name omdat het de eerste keer was en veel andere gels van medestudenten helemaal niets lieten zien. Het is ook geen issue verder hoor als het (helemaal) mislukt is, er wordt meer waarde gehecht aan de documentatie. Wat zou er allemaal verkeerd gegaan kunnen zijn, dat soort vragen (en antwoorden). En dat is ook een beetje waarmee ik worstel op het moment, want heel veel uitleg hebben we niet gehad.

Maar goed, er zijn dus een aantal dingen aan de hand maak ik op uit je reactie. Ten eerste de bandjes van DraI, HaeII en BamHI die op dezelfde hoogte staan. Wat zou hier misgegaan kunnen zijn? Zou het bijvoorbeeld een mogelijkheid zijn dat drie keer (om wat voor reden dan ook) hetzelfde enzym is gebruikt? Her en der zal er ongetwijfeld genoeg fout gegaan zijn. Wat je al zegt: alles lijkt op een druppeltje water. En 1 µL is voor een leek vrij lastig te pipetteren. :P

Wat het tellen betreft... Wat vind je hiervan? Kan dit? Goed zal het vast niet zijn, maar dan kan ik in ieder geval iets tellen.

restrictiefoto2.jpg

En tot slot nog een vraagje... Als de marker te laag ligt, moet ik deze dan gewoon denkbeeldig omhoog zetten? Want de bovenste bandjes van alle enzymen zijn niet echt goed te tellen op deze manier...

#4

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 20 februari 2014 - 16:09

Als je helemaal niets ziet werd er waarschijnlijk lucht gepipetteerd of werden de enzymen te lang op kamertemperatuur bewaard waardoor ze mogelijks werden afgebroken. Enzymen moet je altijd op ijs bewaren. Dat is bij jou allemaal niet het geval dus dat is sowieso goed ;).

Zou het bijvoorbeeld een mogelijkheid zijn dat drie keer (om wat voor reden dan ook) hetzelfde enzym is gebruikt?

Dat lijkt me het meest aannemelijk. Welk enzym je precies gepipetteerd hebt is moeilijk te achterhalen aangezien je de lengte van de bandjes niet kan bepalen vanwege de vreemde merker. Als we die merker mogen geloven heb je je plasmide in stukken geknipt die groter zijn dan 3000bp, wetende dat je oorspronkelijk plasmide maar 2686 bp lang was is dit dus onmogelijk.

Misschien heb je de druppel bij het pipetteren niet goed uit je tip gedrukt, misschien heb je tegen de rand van het epje gepipetteerd en is de druppel boven de vloeistof met het plasmide blijven plakken,... Dat zijn allemaal zaken die kunnen gebeuren. Zoals gezegd en je hierboven reeds aanhaalde, 1µL is niet veel en je moet al goed kijken om te zien of het nu uit of in je pipet zit.

Ik denk dat dit de voornaamste zaken die het vaakst fout gaan (zéker als je het niet gewoon bent). Misschien nog iets, maar ik weet niet of je dat zelf hebt moeten doen. Sommige enzymen hebben serum (bijv. BSA) nodig om optimaal actief te zijn. Mogelijks is iemand vergeten het serum toe te voegen of werd er te weinig serum toegevoegd. Dat zou in principe ook kunnen.

Wat de merker betreft: dat is eigenlijk nog het vreemdste van de hele gel. Ziet die je er bij je medestudenten ook zo uit? Ik bedoel, begint die ook zo laag? Ik vermoed van niet, maar je kan nooit weten. De enige oorzaak die ik momenteel kan bedenken is dat er lokaal iets fout is met de gel. Maar eigenlijk lijkt me dat ook onwaarschijnlijk, aangezien je de gel in één keer giet en dat alles afkomstig is van dezelfde vloeistof. Misschien ging er aan die zijkant iets fout met de polymerisatie. Geen idee.

Wat het tellen betreft... Wat vind je hiervan? Kan dit? Goed zal het vast niet zijn, maar dan kan ik in ieder geval iets tellen.

Dat ziet er niet slecht uit. Het is moeilijk te zien, maar ik zou het 1kb bandje een klein beetje hoger kiezen. Van 0,5kb ben je sowieso zeker, daarboven zou je dan 0,6; 0,7; 0,8 en 0,9 moeten zien liggen.

Ik heb hieronder aangeduid hoe ik het zou doen. (Laat de pijl maar buiten beschouwing, maar dat is waar je het zou verwachten.)

restrictiefoto2.jpg



En tot slot nog een vraagje... Als de marker te laag ligt, moet ik deze dan gewoon denkbeeldig omhoog zetten? Want de bovenste bandjes van alle enzymen zijn niet echt goed te tellen op deze manier...

Neen ;). Dat is foefelen met je resultaten en zou fraude betekenen. Zoiets mag je nooit doen, je mag ook nooit in fotoshop de intensiteit van één bandje verhogen zodat het beter zichtbaar wordt. Je mag zoveel aanpassingen aan die foto doen als je wil, maar dat moet op de volledige foto gebeuren.

Eigenlijk kan je maar twee dingen besluiten:
  • Je gaat uit van een correct gelopen merker (lijkt me sterk) -> maar dan moet je besluiten dat geen enkel digest gelukt is. Dit aangezien alle geknipte fragmenten groter zijn dat je oorspronkelijk plasmide.
  • Je gaat uit van een fout gelopen merker (lijkt me logischer) -> en dan moet je besluiten dat er een digest gelukt is (je weet niet het welke), maar je kan de lengte van de fragmenten onmogelijk bepalen.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#5

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 24 februari 2014 - 19:38

een ladder die een dusdanige fout laat zien is erg onwaarschijnlijk. Je kan soms iets een kromming krijgen over de lengte van een gel maar een dusdanige marge is erg onwaarschijnlijk. Weet je zeker dat je de juiste ladder hebt gebruikt? Ook zal je de volgende keer waarschijnlijk een lager % agarose moeten gebruiken, iets langer de electroforese laten lopen en minder ladder laden.

Technisch gezien mag je niet alle aanpassingen op een figuur doen die je wilt. Niet lineaire aanpassingen van intensiteit is bijvoorbeeld niet correct.

Om digesties te controleren en op te zetten gebruik ik altijd Ape (A plasmid editor)
http://biologylabs.u...sen/wayned/ape/
"Meep meep meep." Beaker






Also tagged with one or more of these keywords: biologie

0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures