Springen naar inhoud

Laag moleculair beta glucaan uitwassen met 50% ethanol


  • Log in om te kunnen reageren

#1

sanderdevink

    sanderdevink


  • >25 berichten
  • 76 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 augustus 2014 - 10:46

Hallo,

 

Ik heb verschillende monsters en de bedoeling is om hier beta glucaan in te bepalen (enzymatisch tot glucose afbreken). In deze monsters zit ook vrij glucose.

Om deze vrije glucose uit te spoelen gebruikt met 50% ethanol. Het nadeel hier van is dat dit ook laag moleculair beta glucaan uitspoelt.

 

Om te bepalen wat het verschil is, doe ik nu elke meting voor elk mosnter met een niet en wel wassing (50% ethanol)

Hieruit kan worden geconcludeerd dat: is er laag moleculair beta glucaan in het monster aanwezig dan is het gehalte beta glucaan hoger voor de niet wassing (immers ook een hoge blanco waarde omdat het vrij glucose niet wordt uitgespoeld).

 

Nu komen er ook monsters voorbij waarbij dit het tegen overgestelde effect heeft! Het gehalte beta glucaan ligt hier hoger voor de wel wassing methode, terwijl dit tegen de logica (mijn logica)  in gaat!

 

Heeft iemand hier een antwoord op hoe dit mogelijk is?

 

Groeten,

 

Sander


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

rwwh

    rwwh


  • >5k berichten
  • 6847 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 04 augustus 2014 - 15:44

Je beschrijft het experiment voor mij niet in voldoende detail om hier iets over te kunnen zeggen. Zou het kunnen dat je uiteindelijk een "concentratie" aan het uitvoeren bent?


#3

sanderdevink

    sanderdevink


  • >25 berichten
  • 76 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 augustus 2014 - 07:02

In een x aantal monsters moet ik het gehalte aan beta glucaan bepalen. Dit wordt uitgevoerd door het monster eerst te wassen met 50% ethanol. Vervolgens volgt er enzymatische hydrolyse om je polysachariden (=beta glucaan) af te breken tot glucose. Door middel van een reactie met een glucose oxidase/peroxidase reagent ontstaat er een kleuren complex. De extinctie wordt vervolgens bepaald op een spectrofotometer.

 

De wassing wordt uitgevoerd om vrij glucose uit je monster te spoelen, je krijgt immers een te hoog gehalte aan beta glucaan als men dit niet doet. Helaas worden door deze wassing ook laag moleculaire beta glucanen uit gewassen.

 

Nu doe ik voor elke monster een niet wassing en een wel wassing. Zo krijg ik bij elke meting 2 waarden. Uit de data blijkt dat er kan worden gesteld: Als men niet wast met 50% ethanol dan worden er hogere gehaltes beta glucaan gevonden (ook hogere blanco waarden, door het vrij glucose in het monster), dit kan worden gesteld aan de hand van het behouden van je laag moleculaire beta glucaan.

 

Deze bevinding uit de data is in mijn ogen dan vrij logisch. Nu komen er echter ook monsters voorbij, waarbij het tegenovergestelde plaats vindt. Als deze monsters worden gewassen met 50% ethanol, worden er hogere gehaltes aan beta glucaan gevonden dan wanneer men deze niet wast. Dit is in mijn ogen niet logisch en kan hier dan ook geen verklaring voor vinden!


#4

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 8933 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 augustus 2014 - 10:34

Waar bestaat de rest van je monster uit? En wat voor gehaltes vind je precies (gewichtspercentages, milligrammen per liter, ...)?

 

Weeg je voor de bepaling een vaste hoeveelheid monster af (.... mg o.i.d.)?

 

In ieder geval kan ik me wel wat voorstellen bij die hogere waardes.

 

Een rekenvoorbeeld:

 

Je monster bevat 20 mg "residu", 40 mg beta-glucaan en 40 mg glucose. Zonder wassen is het beta-glucaangehalte dus 40%. Je meet 80 mg per 100 mg, en hebt een blanco van 40 mg per 100 mg.

 

Laten we er nu van uitgaan dat alle glucose wordt weggewassen en geen beta-glucaan. Na wassen zit er dan 40 mg beta-glucaan in 60 mg monster, 67% dus.

 

Je kunt hiervoor allerlei getallen invullen, maar in het geval dat er wél glucose wordt weggewassen en geen beta-gucaan, neemt het beta-glucaangehalte door het wassen altijd toe.

 

Je zou je dus ook kunnen afvragen waarom het bij jou in sommige gevallen afneemt. Het antwoord daarop is overigens ook vrij eenvoudig: in die gevallen is de fractie van het beta-glucaan dat verdwijnt groter dan de fractie van de totale masse die door het wassen verdwijnt.

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#5

sanderdevink

    sanderdevink


  • >25 berichten
  • 76 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 augustus 2014 - 12:10

@ marko

 

Je mag niet van 67% uitgaan omdat de berekening deelt door het totaal, dus je 100 mg. Dit zal leiden tot eenzelfde antwoord als de niet was. 40mg/100mg

 

Ik weeg 150 - 200 mg monster in.

 

Het gevonden gehalte voor de wel was: 1.0 mg/mL

gevonden gehalte voor de niet was: 0,12 mg/mL

 

Het probleem ligt duidelijk in de wassing met 50 % ethanol.

Het ethanol doet 'iets' met het monster dat er voor zorgt dat je deze wel detecteert, en zodra je deze niet wast niet detecteert


#6

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 8933 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 augustus 2014 - 12:30

Ik vraag ook niet voor niets om duidelijkheid te geven over je meting. Ik geef een mogelijke verklaring, gebaseerd op het gegeven dat je ergens zult moeten delen door een hoeveelheid monster die op een moment is bepaald. Als het anders is moet je dat aangeven.

 

Je bent véél te summier met informatie.

 

Even voor de duidelijkheid. Je weegt dus een monster af. Deze was je wel of niet met 50% ethanol. En dan? Affiltreren en drogen?

Welke stappen zitten er allemaal precies tussen het wassen en het meten van de extinctie?

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#7

sanderdevink

    sanderdevink


  • >25 berichten
  • 76 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 augustus 2014 - 14:44

Ik heb het antwoord gevonden. In mijn monster zit een inhibitor die mijn enzymen deactiveert. Zodra ik een wassing toepas wordt deze inhibitor uitgespoeld, zodat mijn enzymen wel zijn werk kunnen doen.

 

In iedergeval bedankt voor de hulp!


#8

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 8933 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 augustus 2014 - 16:19

Maar is dat een verklaring - en zo ja, wat is dan die inhibitor precies? Of is het een hypothese?

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#9

sanderdevink

    sanderdevink


  • >25 berichten
  • 76 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 06 augustus 2014 - 08:30

Het is een hypothese die ik aanneem. Dit ga ik nog onderzoeken door te prikken op een MS, aan de hand van literatuur willen kijken of er een inhibitor overeen komt met wat ik terug vind.


#10

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 8933 berichten
  • VIP

Geplaatst op 06 augustus 2014 - 12:34

Dat is inderdaad een belangrijke stap. Wat je noemt kan een plausibele verklaring zijn, maar wordt dat pas als je duidelijkheid hebt wat die inibitor dan is.

 

Maar voor je gaat meten: Wat voor effect zie je bij je blanco's?

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#11

sanderdevink

    sanderdevink


  • >25 berichten
  • 76 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 06 augustus 2014 - 14:02

mijn monster blanco voor de niet wassing = 0.041

mijn monster blanco voor de wel wassing = 0.012

 

Er kan dus worden gesteld dat er een klein gehalte aan vrij glucose aanwezig in het moster.


#12

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 8933 berichten
  • VIP

Geplaatst op 06 augustus 2014 - 14:44

Maar je zult dan wel een verklaring moeten vinden waarom het effect van de inhibitor niet optreedt bij je blanco.

 

Bovendien is het raar dat dat effect soms wel optreedt en soms niet. Waarom zit die inhibitor er soms wel in en soms niet?

 

Probeer ook wat andere verklaringen te verzinnen. Wat doe je precies na het wassen? Wordt alles gedroogd, en zo ja, hoe? Is het mogelijk dat er in sommige gevallen nog ethanol aanwezig is?

 

Ethanol kan de gemeten extinctie op verschillende manieren beïnvloeden, doordat de absorptiebanden van het gevormde oxidatieproduct iets verschuiven of meer of minder intens worden.

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#13

sanderdevink

    sanderdevink


  • >25 berichten
  • 76 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 augustus 2014 - 12:15

Het effect in blanco treedt niet op omdat je inprincipe alleen de extinctie meet van een mengsel zonder glucose (voor de wel was), waar alleen de enzymen inzitten. De inhibitor speelt bij de blanco geen rol.  

Voor de niet was, meet je je blanco inc vrij glucose.

 

Waarom de inhibitor in dit monster wel zit, is voor mij nog een raadsel. Ik zou hier een verklaring voor kunnen geven zodra er bekend is wat dit voor inhibitor is. Het monster is van een onbekende leverancier (voor mij onbekend).

 

Naar het wassen komt er een fosfaat buffer bij, dit wordt geincubeerd ik kokend waterbad. Hierna wordt er het enzym lichenase toegevoegd. Het mengsel wordt ook weer geincubeerd en vervolgens wordt er een natriumacetaat buffer toegevoegd, en gecentrifugeerd. Monster worden in twee gesplits. Bij 1 komt het enzym beta glucosidase en bij de ander alleen een natriumacetaat buffer.

Nu al het beta glucaan is omgezet tot glucose, wordt er een glucose oxidase/peroxidase reagens toegevoegd om een kleurencomplex te vormen met het glucose. De extinctie wordt gemeten met een spectrofotometer.

 

De fosfaatbuffer wordt dus toegevoegd aan een nat monster (door het wassen)

Bij het niet wassen komt er geen ethanol meer naar boven. Omdat de fosfaatbuffer dan  aan een droog monster wordt toegevoegd.

 

De extinctie banden kunnen dus iets gaan verschuiven, maar dit zal in mijn inzien niet significant zijn.


#14

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 8933 berichten
  • VIP

Geplaatst op 08 augustus 2014 - 13:19

OK, dat maakt alles een stuk helderder. Inderdaad lijkt het erop dat er wat aan vrij glucose in het monster zit, dat je er in de wasstap uitwast, waardoor het blanco na het wassen minder absorptie laat zien.

 

Alternatief kan natuurlijk zijn dat je er iets anders uitwast dat absorbeert in het betreffende gebied.

 

Met betrekking tot de gemeten extinctie moet je nog 1 ding nagaan, en dat is of je daadwerkelijk extinctie meet - dus even checken of er niet stiekem wat kleine rondzwevende deeltjes zitten die voor verstrooiing zorgen. Op zich zou je verwachten dat dit vooral bij de niet-gewassen monsters zou optreden, maar het is de moeite waard om het even te controleren.

 

Je kunt dit doen door de absorptie over een heel golflengtegebied te meten. In het geval van verstrooiing is de absorptie over dat hele gebied hoger dan de blanco (met eventueel een kleine afhankelijkheid van de golflengte). In het geval van extinctie, waar je naar op zoek bent, zie je duidelijk de absorptiebanden van het oxidatieproduct, en is de rest nageoeg 0.

Cetero censeo Senseo non esse bibendum






0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures