Springen naar inhoud

MyTaq DNA PCR


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Appeltaart123

    Appeltaart123


  • >100 berichten
  • 193 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 oktober 2014 - 16:29

Ik wou de kant-en-klare PCR epjes bestellen via:

 

http://www.bioline.c...aq-red-mix.html

 

Dit om wat meer kennis op te doen betreft het vermenigvuldigen van DNA er staat echter : template, primers en water toevoegen. Met de primers bedoelen ze een hoeveelheid DNA extractie neem ik aan om te vermenigvuldigen? Maar wat bedoelen ze met template?

 

En moet er ook niet een enzym worden toegevoegd om de DNA te knippen? En als laatste de Red Dye kleurstof.. de band is daarmee direct in de elektroforese af te lezen neem ik aan?

 

 


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 26 oktober 2014 - 18:26

Je wil die MyTaq Red Mix bestellen? :shock:  Dat heeft geen enkele zin als je geen PCR toestel hebt of niet op een deftige manier DNA kan bereiden.

 

Met de primers bedoelen ze een hoeveelheid DNA extractie neem ik aan om te vermenigvuldigen?

 Neen helemaal niet! Primers heb je nodig om je PCR reactie in gang te zetten. Ze bepalen welk stuk DNA je gaat amplificeren. Lees eens deze Wikipedia pagina of kijk eens op Bioplek. Uit deze sites ga je veel meer leren dan uit die MyTaq epjes van $98.

 

Maar wat bedoelen ze met template?

Dat is DNA dat je wil aplificeren.

 

En moet er ook niet een enzym worden toegevoegd om de DNA te knippen?

Neen, als je het principe van PCR snapt begrijp je wel waarom. Bekijk zeker die Bioplek link eens die ik hierboven gaf.

 

En als laatste de Red Dye kleurstof.. de band is daarmee direct in de elektroforese af te lezen neem ik aan?

De loading dye zorgt ervoor dat je DNA in de gel zakt zodanig dat je een elektroforese kan doen. Vaak wordt daar inderdaad nog een kleurstof aan toegevoegd, maar dat is louter om gemakkelijk te zien tot waar je DNA loopt. De exacte aflezen doe je onder UV licht.

"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#3

Appeltaart123

    Appeltaart123


  • >100 berichten
  • 193 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 oktober 2014 - 19:35

Dank voor de reactie. ik heb een 2e hands thermal cycler in bezit. Alsmede een elektroforse apparaat incl toebehoren.  Dus dat zit wel goed. De agarosegel was overigens ook 120 euro voor 100 gram.. duur, maargoed kan je wel even mee verder.

 

Nergens was de definitie van template of primer te vinden. Template is dus het te vermenigvuldigen DNA.

 

Primer is mij bekend dat het een start example is van de DNA keten. Echter waar haal ik primers vandaan? ik dacht dat het juist de DNA was die moet worden vermenigvuldigd. 

 

Ik heb geen uv bak.. dus vandaar de kleurstof wel handig is om af te lezen.

 

Bedankt ben nu al een stuk verder!

 

Edit: Het probleem is dus de primers.. hoe kom ik daar aan? De gegeven informatie laat dat niet blijken. 

 

Na de PCR moet de DNA neem ik aan nog geknipt worden?

Veranderd door Appeltaart123, 26 oktober 2014 - 19:56


#4

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 26 oktober 2014 - 22:09

Heb je de Bioplek animatie bekeken? Daar zie je dat je primers nodig hebt bij iedere nieuwe ronde van de amplificatie.

 

Waar haal je die? Meestal design je die eerst via software op de computer en laat je ze daarna synthetiseren bij een gespecialiseerd bedrijf.

 

Maar, wat wil je precies bereiken of wat wil je doen? Want nu heb ik de indruk dat je veel geld gaat uitgeven voor iets dat mogelijk niet gaat lukken of waarvan je niks gaat zien. PCR is echt een heel gevoelig apparaat, dus het is niet zo eenvoudig om daar een huis-tuin-en-keuken experimentje van te maken.

"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill

#5

Appeltaart123

    Appeltaart123


  • >100 berichten
  • 193 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 oktober 2014 - 22:29

Primers zijn dus het probleem.. ok.

 

Hoe deden ze dat 30 jaar geleden dan toen er nog geen computers waren? Mijn familie fokt al jaren hondenrassen voor de overheid (o.a. Politie, speurhonden). Wellicht ga ik dat overnemen van mijn vader , als hij overlijdt. Ik wil daarbij vooral stambomen in tact houden. 

 

Ik ben momenteel 24 jaar (leraar 1e klas biologie). De Primers zijn een onbekend gebied voor me. Voor de rest is alles easy te doen. Een Thermal cyclus is niet eens noodzakelijk, dat kan ook simpel in waterbaden. Het proces moet goed verlopen. Op welke wijze dan ook.

 

En ja, ik beschik over alle apparatuur excl. de uv bak. Ben aan het kijken waar ik deze goedkoop via een universiteit kan krijgen.


#6

Kravitz

    Kravitz


  • >1k berichten
  • 4042 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 28 oktober 2014 - 18:01

Aha, dat maakt veel duidelijk. En het verklaart ook waarom je met "DNA in stukken knippen" in je hoofd zit.
 
Je wil dus zoiets verkrijgen?
 
RFLP_genotyping.gif
 
De techniek waarmee bovenstaande figuur verkregen is heet Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP) en daarmee kan je inderdaad stambomen bepalen. Er zijn echter ook heel wat nadelen aan verbonden. Ten eerste gebruik je hierbij geen PCR waardoor je véél input DNA nodig hebt en daarnaast maakt het gebruik van specifieke probes die niet goedkoop zijn en de procedure behoorlijk omslachtig maken.
 
Tegenwoordig gebruikt men technieken die wel gebaseerd zijn op PCR waardoor je veel minder DNA nodig hebt om te beginnen. Bij de meeste van deze technieken wordt gekeken naar microsatellieten die verborgen zitten in het DNA, dat zijn korte stukken DNA sequentie de verschillende malen herhaald worden (repeats), bijv. TCATTCATTCATTCATTCAT. In sommige mensen komt deze repeat 7x voor terwijl hij bij ander maar 5x of 6x voorkomt, op die manier kan je aan stamboomanalyse doen.
Een probleem van deze techniek is wel dat je moet weten waar je achter die repeats moet zoeken. Eigenlijk komt het er dus opnieuw op neer dat je primers moet hebben om de gewenste repeat te analyseren. Het bepalen van die primers is niet simpel en in jouw situatie volgens mij ook niet haalbaar. Meer details over primer design bij het analyseren van microsatellieten kan je hier lezen.
 
Een andere mogelijkheid heet Amplified Fragment Length Polymorfism (AFLP). Hierbij knip je een DNA sample in stukken en ga je vervolgens aan die stukken adaptors ligeren. De sequentie van die adaptors ken je en als gevolg hiervan kan je daartegen perfect primers designen. Om efficient te werk te gaan moet je de primer wel met één of twee nucleotiden verlengen, zodanig dat je niet alle geknipte stukjes gaat amplificeren, maar slechts een beperkte set (diegene die beginnen met de sequentie van de adaptor én de extra twee nucleotiden bevatten die je toevoegde). Het is belangrijk om deze selectie te doen, anders krijg je een smeer op je gel waaruit je niets kan opmaken. 
 
 

Hoe deden ze dat 30 jaar geleden dan toen er nog geen computers waren?

Uitstekende vraag! En eerlijk gezegd wist ik het antwoord ook niet onmiddellijk. Blijkbaar is er al altijd gebruik gemaakt van gesynthetiseerde primers. Gobind Khorana slaagde er als een van de eerste in om ribonucleotiden aan elkaar te linken waarvoor hij later o.a. de Nobelprijs won.

 

Een Thermal cyclus is niet eens noodzakelijk, dat kan ook simpel in waterbaden.

Met alle respect, maar dat zou ik graag eens op een efficiënte manier willen zien werken... Gebruik die thermal cycler maar ;).

 

 

En ja, ik beschik over alle apparatuur excl. de uv bak. Ben aan het kijken waar ik deze goedkoop via een universiteit kan krijgen.

Belangrijk om te vermelden: DNA licht niet op onder UV, dus je kan het ook niet zomaar visualiseren. Aan agarose gels wordt vaak nog SYBR safe toegevoegd, dat is een organische molecule die intercaleert met het DNA en daarna, onder UV, fluorescent is. Neem hiermee extreme voorzorgsmaatregelen, het intercaleert met DNA, dat wil dus zeggen dat het sterk mutageen is! Die maatregelen gaan zelfs zover dat wanneer bijv. een met SYBR safe gecontamineerde gel in aanraking komt met jouw schoen, die schoen per definitie voor de vuilbak is. 

 

Tot slot nog twee vragen:

  • Heb je enig idee hoe je DNA gaat bereiden? Bij muizen wordt dat gedaan door een klein stukje van het topje van de staart af te knippen, maar ik weet niet of je dat bij honden ook zomaar kan/mag doen.
  • Wat ga je doen met je afval? Een gel met SYBR safe mag niet zomaar in je vuilbak belanden... daar zijn speciale tonnen voor die door speciale firma's worden opgehaald. Bekijk dat ook eens.
"Success is the ability to go from one failure to another with no loss of enthusiasm" - Winston Churchill





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures