(Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

Moderator: ArcherBarry

Reageer

Bericht 04-03-'16, 11:01

Marijn van Gelder

Berichten: 5

(Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

Hoi,
 
Ik heb vorige week een toxi-chromotest uitgevoerd op het lab met als doel ''onderzoeken in hoeverre bacterie kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid/toxiciteit van bepaalde stoffen aan te kunnen tonen''. Hierbij is gebruik gemaakt van E. coli bacteriën en gekeken naar welke invloed toxische stoffen (waterstofperoxide en formaldehyde in dit geval) hebben op de aanmaak van eiwitten/enzymen. Deze bacterie maakt alleen enzymen die de bacterie ook daadwerkelijk nodig heeft (inductie). Een van de betrokken enzymen is B-galactosidase, waarbij lactose dus de aanmaak van dit enzym induceert. Inductie kan ook plaatsvinden door stoffen die niet zelf worden verteerd, zo induceert de stof IPTG ook de synthese van B-galactosidase. Om het enzym B-galactosidase aan te tonen kun je de stof ONPG (ortho-nitrofenyl-galactosidase) gebruiken. B-galactosidase zet ONPG om in galactose en ortho-nitrofenol. De laatste stof is goed te meten bij een extinctie van 420 nm.
 
Tijdens dit practicum hebben we 18 reageerbuizen genummerd (1/8 formaldehyde, 9/16 waterstofperoxide en 17/18 controle zonder toxische stof). Hier is 0.5 ml bacteriesuspensie aan toegevoegd samen met 0.5 ml reactiemix (onder andere NaCl, KCl, nafosfaatbuffer) en 1 ml toxische stof (met verschillende concentraties, van beide stoffen is een verdunningsreeks gemaakt met de concentraties 50mM, 10mM, 1mM en 500 uM en dit hebben we 30 minuten laten incuberen. Na deze 30 minuten is er ONPG-broth bijgevoegd om de kleurreactie te ontwikkelen. Dit is vervolgens weer 30 minuten geincubeerd. 
 
Na deze incubatie moesten we de OD420 en OD600 meten van de vloeistoffen in de reageerbuizen. Per reageerbuis hebben we dus 2 meetwaarden. Het lastige is dat we nu een dose-response curve moeten maken, maar geen flauw idee hebben hoe. Op de X-as moet de concentratie in logaritmische schaal maar wat moet op de Y-as? 
 
Afbeelding
 
Dit zijn onze (gemiddelde) meetwaarden.
 
Ik hoop dat iemand mij duidelijk kan maken wat er op de Y-as moet want wij komen er maar niet uit.
 
Alvast bedankt! (ik weet trouwens niet of ik hier goed gepost heb, anders moet een mod de post maar even verplaatsen)
Omhoog

Bericht 04-03-'16, 11:49

Jaffaa

Berichten: 83

Re: (Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

de activiteit van het enzym meet je dus bij abs 420, hoe meer substraat het enzym kan omzetten hoe 'geler' je oplossing word. 
 
bij abs600 met je de hoeveelheid bacteriën je hebt in je oplossing, dus kan je zien of je stofje ook daadwerkelijk invloed heeft op de groei van de bacteriën. dit zet je in een aparte grafiek uit, lijkt mij. dus uiteindelijk krijg je 4 grafieken, en voor elke stof 1 voor de enzym activiteit en 1 voor de groei. 
 
je moet wel even je blanco meting van deze waardes afhalen om te normaliseren, je kan eventueel ook nog de IC50 oid uit dit soort grafieken halen..
 
google trouwens even op dose-response curve and absorbance, als je dan bij afbeeldingen kijkt zie je hoe er ongeveer uit moet komen te zien?
 
is dit een beetje duidelijk? zoniet, vraag maar raak dan probeer ik je verder te helpen :)
Omhoog

Bericht 04-03-'16, 12:02

Marijn van Gelder

Berichten: 5

Re: (Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

Jaffaa schreef: de activiteit van het enzym meet je dus bij abs 420, hoe meer substraat het enzym kan omzetten hoe 'geler' je oplossing word. 
 
bij abs600 met je de hoeveelheid bacteriën je hebt in je oplossing, dus kan je zien of je stofje ook daadwerkelijk invloed heeft op de groei van de bacteriën. dit zet je in een aparte grafiek uit, lijkt mij. dus uiteindelijk krijg je 4 grafieken, en voor elke stof 1 voor de enzym activiteit en 1 voor de groei. 
 
je moet wel even je blanco meting van deze waardes afhalen om te normaliseren, je kan eventueel ook nog de IC50 oid uit dit soort grafieken halen..
 
google trouwens even op dose-response curve and absorbance, als je dan bij afbeeldingen kijkt zie je hoe er ongeveer uit moet komen te zien?
 
is dit een beetje duidelijk? zoniet, vraag maar raak dan probeer ik je verder te helpen :)
Ah ja dit verduidelijkt de boel al, ik ben er zelf niet op gekomen om absorbance achter dose-response curve te zetten, dom, maar het is nu wel duidelijker hoe hij eruit moet komen te zien inderdaad. Ik zou eventueel ook 2 grafieken kunnen maken, 1 OD420 en 1 OD600 denk ik? 
Omhoog

Bericht 04-03-'16, 16:27

Jaffaa

Berichten: 83

Re: (Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

ja dat kan je inderdaad zeker doen :), ik bedoelde met die 'grafieken' dat je 4 lijnen krijgt, hoe je die uiteindelijk in de lay out doet moeten jullie helemaal zelf weten, at het makkelijkst is en ook overzichtelijkst.. denk dan vooral aan wat je boodschap is bij het figuur.
Omhoog

Bericht 04-03-'16, 16:36

Marijn van Gelder

Berichten: 5

Re: (Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

Jaffaa schreef: ja dat kan je inderdaad zeker doen :), ik bedoelde met die 'grafieken' dat je 4 lijnen krijgt, hoe je die uiteindelijk in de lay out doet moeten jullie helemaal zelf weten, at het makkelijkst is en ook overzichtelijkst.. denk dan vooral aan wat je boodschap is bij het figuur.
Alright, dan heb ik dat gedeelte klaar. Heb jij misschien enig idee hoe je de toxiciteit berekend? In het artikel staat de volgende formule:
%Toxiciteit = (1-OD treated cells / OD controle cells) * 100. Het geval is dat we twee golflengtes hebben gebruikt maar welke van de twee moet gebruikt worden?
 
Bedankt voor je hulp tot nu toe trouwens!
Omhoog

Bericht 07-03-'16, 09:45

Jaffaa

Berichten: 83

Re: (Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

Je heb per conditie toch maar 1 od? De van 600 zegt iets over de groei van de bacteriën en die van 420 over de werking van het enzym

Dus de (abs420 van 1 conditie/ abs420 controle) *100

Dit moet je dan 4x doen ( dan krijg je dus die 4 grafieken...
Omhoog

Bericht 07-03-'16, 15:48

Marijn van Gelder

Berichten: 5

Re: (Toxicologie) Een dose-response curve maken, hoe?

Jaffaa schreef: Je heb per conditie toch maar 1 od? De van 600 zegt iets over de groei van de bacteriën en die van 420 over de werking van het enzym

Dus de (abs420 van 1 conditie/ abs420 controle) *100

Dit moet je dan 4x doen ( dan krijg je dus die 4 grafieken...
Ik heb de juiste formule al, deze stond niet in het artikel maar ergens los in een presentatie dus vandaar de verwarring.
 
%Toxiciteit = (1 –(ABS 420 / ABS600 behandelde cellen) / (ABS 420 / ABS 600 controle cellen)) * 100
 
Ik heb het verslag inmiddels ingeleverd, nogmaals bedankt voor de hulp :)
Omhoog
Reageer

Terug naar “Moleculaire biologie en biochemie”