Resultaat Mutagenese PCR

FlipFlop

Hallo iedereen,

Ik heb een mutagenese PCR uitgevoerd (Quikchange Site-directed mutagenesis kit van Stratagene) en hierna heb ik het PCR mengsel op een agarosegel gezet. Links heb ik een ladder geladen en de 2 rechtse laantjes zijn eenzelfde PCR-mengsel. Echter heb ik een heel ander resultaat verkregen dan ik gehoopt had (rechts is het gehoopte resultaat). Ik had namelijk gehoopt een gel te krijgen zoals jullie in bijlage kunnen zien (zie de agarosegel met links en rechts telkens 1 ladder). Weet iemand misschien de oorzaak van mijn rare bandjes op mijn gel? Waar zou het fout kunnen gelopen zijn?

Jaffaa

het had handig geweest als je de laantjes nummer had gegeven en dan beschreven wat we zagen.. het klinkt een klein beetje vaag nu

als ik het goed begrijp heb je op de linker gel (v.l.n.r) je ladder, je sample en in de derde laan weet ik niet..

maar goed, ik denk dat je misschien een pipetteer fout hebt gemaakt, het lijkt erop dat je ladder in het laantje is gekomen van je sample, je ziet namelijk wel duidelijk een bandje onderaan (wat lijkt op dezelfde band uit de rechter gel), heb je nieuwe pipet punt gebruikt bij pipetteren van sample? kan het zijn dat er een beetje van de ladder in het slotje is gekomen van het sample?

ik adviseer om je gel opnieuw te runnen, dan je ladder helemaal links te doen, 2 slotjes open en het sample met een nieuwe pipetpunt pipetteren..

daarnaast vraag ik me af of de ladder die je hebt gebruikt wel de goeie is.. je verwachte PCR product kan je nooit vergelijken met de ladder want die ladder komt niet ver genoeg..

FlipFlop

Ik zal even wat meer info geven! Op de foto links zie je in deze volgorde: ladder - staal 1 en 2 (beide dezelfde stalen). Deze 2 stalen zijn afkomstig via mutagenese van TDP1 cDNA. Ik heb namelijk een TDP1 Thr261Pro mutatie, een pcDNA-TDP met myc tag als matrijs en 2 (forward en reverse) primers gebruikt. En ik denk idd dat er wat misgelopen is met het pippeteren en dat er wat van de ladder in laan 2 is gekomen.
Echter de rechtse afbeelding is het correcte resultaat en toch is er in laan 2 ook een soort smeer bovenaan te zien. Wat zou hiervan de oorzaak kunnen zijn?

Jaffaa

maar je verwacht dan toch dat je een product ziet van dezelfde lengte in laan 2 en 3 (linker gel), echter in laan 2 zie je wel duidelijk een band ter hoogte van het te verwachten PCR product!?! en in laan 3 zie je dat eigenlijk niet?

voor de smeer in de rechtergel: zie dit topic, er zijn veel mogelijke verklaringen te verzinnen.. https://www.researchgate.net/post/Why_am_I_getting_smearing_after_PCR

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Resultaat Mutagenese PCR

Resultaat Mutagenese PCR

Re: Resultaat Mutagenese PCR

Re: Resultaat Mutagenese PCR

Re: Resultaat Mutagenese PCR