Ik doe onderzoek naar een nieuw op te zetten essay met elisa om HDM specifiek IgE in de muis aan te tonen met behulp van anti rat IgE,
D1(matrix met biotine groepen en recombinant derp1) en muizen serum. maar naar 8 keer het te veranderen blijft onze blanco een positive waarde geven en meetsal nog hoger dan de startwaarden.
Dit is onze assay tot nu toe:
- Coat een 96 wells plaat(maxisrop) met capture IgE + sodiumcarbonaat. De verdunning staat op 1/250, Dit een nacht laten incuberen op kamertemperatuur in een vochtige omgeving.
- Was de 96 well 3x kort met PBS
- Voeg 300µl block(10% FCS)per well toe, en laat dit voor 1 uur incuberen.
- Was de 96 well 3x kort met PBS
- Voeg 50 µl verdund serum per well. Je start met 30 µl serum+ 90 µl PBS(1/4) daarna verdun je 2x tot aan well 11(4096X verdund)
- Je zet de 96 well plaat in de 37 broedstoof in een vochtige omgeving voor 2 uur.
- Was de 96 well 3x maal kort met PBS
- Voeg 50 µl D1(matrix met biotine groepen en recombinant derp1) en laat dit 2 uur incuberen bij normale kamertemperatuur in een vochtige omgeving.
- Was de 96 well 3x kort met PBS
- Voeg 50 µl streptavidine HRP 1:1000 en laat dit 30 min incuberen
- Was de 96 well 3x kort met PBS
- TMB substraat toe voeg 50 µl je het stopsolution toe om de reactie te stoppen.
- en zet je 96 well plaat in de spectrofotometer bij een extinctie van 450nm en een referentie van 650nm
well 1:0,576, 2:0,453, 3:0,330, 4:0,269, 5:0,201, 6:0,158, 7: 0,137, 8:0,125, 9:0,123, 10:0,107, 11: 0,153 and well 12 the blank 0,611
Nu willen wij weten waarom altijd de blanco een positieve warden geeft, kan iemand ons daarmee helpen?
hartelijk dank alvast