Probleem met speciafiek IgE ELISA

Moderator: ArcherBarry

Forumregels
(Middelbare) school-achtige vragen naar het forum "Huiswerk en Practica" a.u.b.
Zie eerst de Huiswerkbijsluiter
Reageer
Berichten: 1

Probleem met speciafiek IgE ELISA

Hallo,
 
Ik doe onderzoek naar een nieuw op te zetten essay met elisa om HDM specifiek IgE in de muis aan te tonen met behulp van anti rat IgE, 
D1(matrix met biotine groepen en recombinant derp1) en muizen serum. maar naar 8 keer het te veranderen blijft onze blanco een positive waarde geven en meetsal nog hoger dan de startwaarden.
  
Dit is onze assay tot nu toe:
 
  1. Coat een 96 wells plaat(maxisrop) met capture IgE + sodiumcarbonaat. De verdunning staat op 1/250,  Dit een nacht laten incuberen op kamertemperatuur in een vochtige omgeving.
  2. Was de 96 well 3x kort met PBS
  3. Voeg 300µl block(10% FCS)per well toe, en laat dit voor 1 uur incuberen.
  4. Was de 96 well 3x kort met PBS
  5. Voeg 50 µl verdund serum per well. Je start met 30 µl serum+ 90 µl PBS(1/4) daarna verdun je 2x tot aan well 11(4096X verdund)
  6. Je zet de 96 well plaat in de 37   broedstoof in een vochtige omgeving voor 2 uur.
  7. Was de 96 well 3x maal kort met PBS
  8. Voeg 50 µl D1(matrix met biotine groepen en recombinant derp1) en laat dit 2 uur incuberen bij normale kamertemperatuur in een vochtige omgeving.
  9. Was de 96 well 3x kort met PBS
  10. Voeg 50 µl streptavidine HRP 1:1000 en laat dit 30 min incuberen
  11. Was de 96 well 3x kort met PBS
  12. TMB  substraat toe voeg 50 µl je het stopsolution toe om de reactie te stoppen.
  13. en zet je 96 well plaat in de spectrofotometer bij een extinctie van 450nm en een referentie van 650nm
het resultaat:
well 1:0,576, 2:0,453, 3:0,330, 4:0,269, 5:0,201, 6:0,158, 7: 0,137, 8:0,125, 9:0,123, 10:0,107, 11: 0,153 and well 12 the blank 0,611
 
Nu willen wij weten waarom altijd de blanco een positieve warden geeft, kan iemand ons daarmee helpen?
 
hartelijk dank alvast
 
 

Berichten: 83

Re: Probleem met speciafiek IgE ELISA

wanneer je het substraat toevoegt, hoelang incubeer je dan? weet je hoelang het enzym nodig heeft om het substraat om te zetten? langer incuberen misschien een optie?
 
dat je blanco een positieve waarde heeft kan, dit is gewoon achtergrond wat je van al je metingen afhaalt.. maar 0,611 lijkt mij idd ook wat aan de hoge kant.. ik zou tevens adviseren om alles in triplo te doen,, kan je er toch met iets meer zekerheid wat over zeggen.. 
beschrijf eens wat er in je blanco welletje zit..

Reageer