Beste Wetenschappers, ik heb 2 vragen over DNA extractie en enzymatische lyse
Bij een DNA-extractie is een eerste stap de lyse.
Hier is er een mechanische en enzymatische destructie doordat de celwand kapot gaat en RNAse bijvoorbeeld het RNA kan gaan afbreken. In deze lyse stap, gebruik ik een lysis buffer. Deze bevat oa EDTA. Ik had gevonden dat in de lyse stap RNA kan worden afgebroken en DNA niet. Dit EDTA capteert Ca2+ en Mg2+ waardoor DNA niet wordt afgebroken (werking van DNAse wordt afgeremd). Kan RNAse deze cofactoren niet gebruiken en is het dan daardoor dat het RNAse niet wordt afgeremd in deze stap?
Daarnaast vraag ik mij af ik wat enzymatische lyse nu precies inhoudt bij DNA-extractie als er geen extra enzymen werden toegevoegd aan de afgenomen stalen. Zijn er dan gewoon enzymen aanwezig in het staal die dan de celwand afbreken?
Laatste berichten
-
13:44
do-re-mi-fa-so vliegtuigen 6
-
13:43
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 2
-
11:32
[scheikunde] Kan chloorgas de geleiding van elektriciteit belemmeren? 6
-
11:31
geen minkowski-ruimte toch? Doe ik dit nou fout? 14
-
10:42
projectiel 8
-
10:37
Verschil tussen deze 2 vragen 5
-
09:48
Schroefdraad berekening 4
-
09:25
[scheikunde] berekeningen labo vitamine c bepaling 1
-
19:29
[wiskunde] rode en witte ballen verdelen 8
-
17:23
Rotatie van het heelal 41
-
22 apr
Weerfrustratie 5
-
22 apr
Muntje opgooien 14
-
21 apr
Reactiviteit silyl enol ethers 1
-
21 apr
Criterium voor vochtretentie
-
21 apr
speciale rel. theorie 5
-
21 apr
Vogels in de stad zijn goede klussers
-
21 apr
Ervaringen met "herontdekkingen" 15
-
20 apr
Herleiden afmetingen vanaf een foto 19
-
20 apr
Stank rotte eieren uit de warmwaterboiler 11
-
20 apr
Nut warmtepomp 18
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
Cofactoren RNAse en enzymatische lyse
Moderator: ArcherBarry
-
- Moderator
- Berichten: 5.238
Re: Cofactoren RNAse en enzymatische lyse
Wat als er in elke cel "gewoon" enzymen aanwezig zijn (in voldoende maten) welke celwanden afbreken. In dat geval heb je een probleem want dan is het niet mogelijk om intacte cellen te hebben.
Daarnaast is het ook belangrijk de juiste enzymen te gebruiken. Planten cellen zijn anders opgebouwd (lees koolhydraten als cel wand materiaal) dan dierlijke celwanden (eiwitten). Het toevoegen van de juiste enzymen moet dus gebeuren, gezien de kans klein is dat in het monster deze enzymen al aanwezig zijn.
Daarnaast is het ook belangrijk de juiste enzymen te gebruiken. Planten cellen zijn anders opgebouwd (lees koolhydraten als cel wand materiaal) dan dierlijke celwanden (eiwitten). Het toevoegen van de juiste enzymen moet dus gebeuren, gezien de kans klein is dat in het monster deze enzymen al aanwezig zijn.
Niet geschoten is altijd mis, en te snel schieten vaak ook.
Ik ben intelligent want ik weet dat ik niks weet. Socrates
Ik ben intelligent want ik weet dat ik niks weet. Socrates
-
- Berichten: 7
Re: Cofactoren RNAse en enzymatische lyse
Beste,
bedankt voor de snelle respons! Laat ik het wat anders formuleren:
in mijn thesis heb ik DNA-extracties moeten doen. Dit deed ik als volgt: toevoegen van glass beads en lyse buffer (bevat oa tris, EDTA, NaCl, natriumdodecylsulfaat, polyvinylpyrrolidone) en dit werd dan in de fastprep gebracht. Hierna werd een fenol-chloroform- isoamylalcohol mengsel toegevoegd, gevolgd door chloroform (om eiwitten te doen neerslaan). Als laatste werd natriumacetaat en isopropanol toegevoegd om het DNA te doen neerslaan.
Mijn begeleidster vertelde me dat er nog RNA kan aanwezig zijn in het extract, maar dat dit sterk gereduceerd is. RNA zou namelijk ook (naast eiwitten en lipiden) neerslaan bij de vloeistof-vloeistof extractie met fenol-chloroform-isoamyl en isopropanol.
Nu is mijn vraag: hoe wordt een deel van het RNA neergeslaan? Wordt dit afgebroken bij de lyse, waardoor deze meer apolair wordt en ook oplost in de apolaire fase bij de vloeistof-vloeistof extractie?
Alvast bedankt.
bedankt voor de snelle respons! Laat ik het wat anders formuleren:
in mijn thesis heb ik DNA-extracties moeten doen. Dit deed ik als volgt: toevoegen van glass beads en lyse buffer (bevat oa tris, EDTA, NaCl, natriumdodecylsulfaat, polyvinylpyrrolidone) en dit werd dan in de fastprep gebracht. Hierna werd een fenol-chloroform- isoamylalcohol mengsel toegevoegd, gevolgd door chloroform (om eiwitten te doen neerslaan). Als laatste werd natriumacetaat en isopropanol toegevoegd om het DNA te doen neerslaan.
Mijn begeleidster vertelde me dat er nog RNA kan aanwezig zijn in het extract, maar dat dit sterk gereduceerd is. RNA zou namelijk ook (naast eiwitten en lipiden) neerslaan bij de vloeistof-vloeistof extractie met fenol-chloroform-isoamyl en isopropanol.
Nu is mijn vraag: hoe wordt een deel van het RNA neergeslaan? Wordt dit afgebroken bij de lyse, waardoor deze meer apolair wordt en ook oplost in de apolaire fase bij de vloeistof-vloeistof extractie?
Alvast bedankt.
-
- Berichten: 8.557
Re: Cofactoren RNAse en enzymatische lyse
Als RNA is afgebroken tijdens de lyse dan zal je dit niet neer kunnen slaan. Juist alleen wanneer je met een groot macromolecuul te maken hebt zal je RNA neer kunnen slaan. Ditzelfde geld trouwens ook voor DNA. Voor de rest staat hier een duidelijke uitleg.
"Meep meep meep." Beaker
