Wetenschapsforum

Voor de bepaling van het totale eiwitgehalte via de methode van Bradford:

waarom moet de gemeten absorbantie van het ongekende staal bij 595 nm lager dan 0,5 zijn? (indien deze hoger ligt, moet verdund worden) Ik vermoed dat dit te maken zal hebben met afbuiging van de bekomen ijklijn bij hogere concentratie, (ijklijn opgesteld via serumalbumine standaard met conc 0; 1; 4; 7,5; 10; 25 ug/mL) maar mss weet iemand er meer over?

Het is al weer een tijdje terug dat ik mijn laatste bradford assay heb gedaan. Het is inderdaad zo dat wanneer men een bradford assay uitvoerd, deze moet worden gedaan met een lineaire callibratiecurve (ijklijn). Als de extinctie te hoog wordt, dan moet men inderdaad het monster gaan verdunnen. Anders zal de extinctie niet meer lineair afbuigen en zal er een kromme ontstaan. Nu weet ik alleen niet zeker of dit bij 0,5 was of bij 1,0. Als men het heeft over 0,5 dan zou ik dit aannemen als correct. Een bradford assay is zeker lineair tot een concentratie van 500 mu.gif g/ml (let op in 0,9 m/m % NaCl). Je moet 0,9% NaCl oplossing dus ook gebruiken als blanco. Je moet je callibratiereeks aanpassen. De concentraties die je nu wilt bepalen zijn veel te laag om er ook maar iets nuttigs over te kunnen zeggen (de fout zal te groot zijn), de fout zal dan veel te groot zijn.

De bradford methode is de meest populaire. Persoonlijk zou ik echter kiezen voor biureetmethode (let natuurlijk wel even op de bereiken van beide methoden; biureet in mg/ml, bradford in mu.gif g/ml.) De biureet methode geeft een kleinere fout (zelf experimenteel bepaald), dit komt waarschijnlijk doordat de reactietijd van de biureetmethode 30' is terwijl de reactie tijd voor de bradford methode 5' is. Dit scheelt aanzienlijk in de tijd die nodig is.

Ik wil je ook aanraden om microtiterplaten te gebruiken. Maak een callibratiecurve van 100, 200 ,300 ,400 en 500 mu.gif g/ml. Het monster moet ongeveer in het midden liggen. Dat komt dus neer op 200-300 mu.gif g/ml. Vergeet als blanco niet de o,9 m/m % NaCl oplossing te nemen. Mocht je twijfelen over de concentratie van je monster, maak dan een aantal verdunningen.

Als je een microtiterplaat gebruikt (8X12 Greiner) gebruik de eerste 6 rijen dan om de blanco en de callibratiecurve in te maken, en de 2 andere rijen om een monster bepaling te doen. Natuurlijk moet je hiervoor een multichannel pipet gebruiken. Alle 12 de kolommen kunnen worden gevuld. De fout die je hierdoor krijgt wordt veel lager.

Nog een aantal opmerkingen:

Let op dat je het juiste CBB reagens gebruikt (CBB G-250)

filter het reagens voor gebruik (filter selecta 595 1/2)

Let op de houdbaarheid van het reagens (2 weken bij 20^oC)

Let op dat er geen luchtbellen in de oplossing in de microtiter platen ontstaan. Dit breekt het licht af en zorgt voor een waardeloze meting. Deze zijn te verwijderen met een kleine pipetpunt.

Als alle stoffen in de microtiterplaat zitten, dan moet je deze meteen schudden (zijn speciale apparaten voor) voor de volledige 5' die staan voor de reactietijd.