Springen naar inhoud

LAM-PCR


  • Log in om te kunnen reageren

#1

smurfin

    smurfin


  • 0 - 25 berichten
  • 25 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 26 maart 2006 - 17:39

Hallo,
kan er mij iemand uitleggen hoe de LAM-PCR techniek werkt die toelaat om te bepalen waar het genoom van een retrovirale vector zich heeft gezet in het humaan DNA? (gen therapie) Deze techniek zou zijn ontwikkeld door von Kalle en Schmidt. Op het net vond ik onderstaande link. Maar als chemist is mijn kennis beperkt tot de begrippen zoals PCR, restrictie enzym, primer. Ik doe dus een beroep op al de biotechnologen hier aanwezig. Alvast bedankt


http://www.bloodjour...l/100/8/2737/F1

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Magda

    Magda


  • >25 berichten
  • 45 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 31 maart 2006 - 09:03

Hallo,  
kan er mij iemand uitleggen hoe de LAM-PCR techniek werkt die toelaat om te bepalen waar het genoom van een retrovirale vector zich heeft gezet in het humaan DNA? (gen therapie) Deze techniek zou zijn ontwikkeld door von Kalle en Schmidt. Op het net vond ik onderstaande link. Maar als chemist is mijn kennis beperkt tot de begrippen zoals PCR, restrictie enzym, primer. Ik doe dus een beroep op al de biotechnologen hier aanwezig. Alvast bedankt


http://www.bloodjour...l/100/8/2737/F1

Kan je misschien aangeven waarom je dit wilt weten?
Als je weinig kennis van zaken hebt zal het lastig te begrijpen zijn.
Ik zal een poging wagen....

Geplaatste afbeelding

Met deze techniek kan je opsporen waar in het genoom een virus geintegreerd is. Je weet natuurlijk niet de sequentie van het stuk waar het virus geintegreerd is (anders had je dat ook niet hoeven opsporen ;-)), dus je maakt gebruik van de sequentie van het virus (die ken je wel). Je gebruikt een oligo (=primer) complementair aan de virus cDNA sequentie (LTR1) en je laat deze biotinyleren bij het bedrijf waar je deze besteld. Je doet LTR1 bij het DNA en doet een PCR mbv Taq polymerase. Dan wil je dit stukje isoleren (omdat dit stukje DNA alle informatie bevat die je nodig hebt. Het heeft namelijk een stuk viraal DNA en een stuk genomisch DNA. Als je dit dus kan sequencen weet je waar het DNA geintegreerd is....). Het isoleren doe je met avidin beads (je primer was gebiotinyleerd). Dan heb je dus ss DNA en met random priming maak je hier ds DNA van. Omdat je nog niet weet wat voor sequentie aan de linkerkant van je stuk DNA zit doe je de volgende truc: Digesteer (knip) het DNA met Sse. Dit is een restrictie enzym wat in theorie 1 keer zal knippen per 256 bp. Waar hij knipt weet je dus niet. Dan heb je dus een overhang aan je DNA zitten. Je hebt oligo's laten synthetiseren die samen een Ligation cassette vormen (LC) en die past precies op de overhang van de Sse site.
Nu heb je dus aan beide kanten van het stukje DNA bekende DNA sequenties en kan je het PCR product verder amplificeren (meer van maken). Dit doen ze met oligo's (primers) die net iets verschoven zijn, LTRII en LTRIII en LC2. Dit product (of producten (als er meerdere integration sites zijn)), kan je kloneren en sequencen en JOEPIE de DNA sequentie van de integratie site is bekend en je kan met blast searches op het internet nagaan op welk chromosoom dit is en waar op dat chromosoom het is.

Duidelijk zo?





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures