Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen

Napoleon Dynamite

Kan iemand me heel kinderlijk uitleggen hoe het proces van gerichte homologe recombinatie verloopt bij een knockout procedure bij transgene muizen?

Dit heb ik vertaald uit een te kennen artikel voor mijn examen:

"Creatie van een nul allel door gerichte recombinatie in embryonale ES stamcellen.

Hier wordt een genfragment met zeven exons (grijze vakjes) gewist = knockout.

Sequenties A en B van intron 1 en 6 doen hier dienst als doelsequenties.

Het plasmide bevat een negatieve DT-A marker die giftig is voor cellen en bevat de positieve selectie NeoR (neomycine-resistentie)

Bij homologe recombinatie wordt het plasmide en de DT-A marker verwijderd, bij random recombinatie blijft de DT-A marker meestal behouden (deze cellen zullen dus afsterven)."

Wat doet die DT-A marker?

Wat doet de positieve selectie NeoR?

Welk DNA wordt gewist?

Wat bedoelt men eigenlijk met homologe recombinatie bij transgene muizen?

eureka126

Napoleon Dynamite schreef:Kan iemand me heel kinderlijk uitleggen hoe het proces van gerichte homologe recombinatie verloopt bij een knockout procedure bij transgene muizen?

Dit heb ik vertaald uit een te kennen artikel voor mijn examen:

"Creatie van een nul allel door gerichte recombinatie in embryonale ES stamcellen.

Hier wordt een genfragment met zeven exons (grijze vakjes) gewist = knockout.

Sequenties A en B van intron 1 en 6 doen hier dienst als doelsequenties.

Het plasmide bevat een negatieve DT-A marker die giftig is voor cellen en bevat de positieve selectie NeoR (neomycine-resistentie)

Bij homologe recombinatie wordt het plasmide en de DT-A marker verwijderd, bij random recombinatie blijft de DT-A marker meestal behouden (deze cellen zullen dus afsterven)."

Wat doet die DT-A marker?

Wat doet de positieve selectie NeoR?

Welk DNA wordt gewist?

Wat bedoelt men eigenlijk met homologe recombinatie bij transgene muizen?

Ik zal hier meerder keren op reageren omdat je meerdere vragen in 1 keer stelt, en omdat het de nodige tijd kost om ze goed te beantwoorden.

Ik begin met de DT-A marker.

DT-A staat voor diphtheria toxin A. DT-A is giftig voor dierlijke cellen, en zorgt er dus voor dat dierlijke cellen die dit produceren zichzelf ombrengen. Diphtheria toxine is giftig doordat het de eiwit synthese blokkeert. Het is zeer effectief omdat het direct ingrijpt op het proces van verlenging van de aminozuurketens voor de synthese van nieuwe eiwitten. Doordat het dit proces blokeert kan de cel geen nieuwe eiwitten maken en sterft het af.

Ik hoop dat dit duidelijk maakt wat DT-A is en waarom dit een giftige stof is voor de dierlijke cel, je andere vragen zal ik later beantwoorden.

eureka126

Napoleon Dynamite schreef:

Wat doet de positieve selectie NeoR?

neoR staat inderdaad voor neomycine resistentie. NeoR is het gen dat hiervoor codeert.

Neomycine is giftig omdat ook deze stof de eiwit synthese verstoort. NeoR codeerd voor het enzyme neomycine phosphotransferase,

een enzyme dat voor resistentie zorgt doordat het neomycine dusdanig veranderd dat het niet meer giftig is.

De positieve selectie wordt bereikt door dierlijke cellen te laten groeien in voedingmedium waarin zich neomycine of een op neomycine lijkende stof bevindt. Alleen cellen die de marker (het NeoR gen) hebben zullen overleven.

Magda

Kan je de figuren uit het artikel hier even plaatsen, dan is het makkelijker uit te leggen. Of heb je voor mij de referentie? (titel, auteurs, tijdschrift, vol.no, jaar enz, aannemende dat het een bestaand, origineel artikel is?) Dan zoek ik hem even op. Meeste artikelen kan ik wel aankomen.

Alvast enige reacties:

Het staat een beetje raar omschreven: als intron 1 en 6 de 'target sequences' zijn, zal je dus waarschijnlijk exon 2 tot en met exon 6 verwijderen En niet 7 exons zoals er staat. Maar voor dit soort details moet je het artikel er echt bij hebben.

Ze zullen het NeoR (Neomycine Resistence) gen tussen de 'target sequences' gezet hebben waardoor er bij homologe recombinatie exonen verwijderd worden en er een NeoR in het gen gezet wordt. Hier kan je tijdens het kweken op selecteren.

Dat suicide gen ken ik niet zo goed, maar blijkbaar gebruiken ze dat om te selecteren tegen foute recombinatie...... alleen als het goed gegaan is heb je dus Neo+, DT-A negatieve cellen. Bij random integratie zijn de cellen dus DT-A positief (en random integratie wil je niet)

Homologe recombinatie is dus een proces in eicellen en zaadcellen om genetische diversiteit te verhogen. Het wordt ook wel cross-overs genoemd. Je moet zelf in je boeken maar nazoeken wat het is (en ook overal te vinden op internet). Je gebruikt deze eigenschappen van DNA op een slimme manier bij het maken van transgene muizen.

Napoleon Dynamite

Artikel Roger H. Reeves

Exploring Development and Diseases through germ-line genetic engineering in the mouse.

Link

Noot: ik ben maar een simpele psycholoog die weinig kaas heeft gegeten van DNA. Ik ben al blij als ik het principe snap. Toch al bedankt voor de reacties

eureka126

Napoleon Dynamite schreef:Artikel Roger H. Reeves

Exploring Development and Diseases through germ-line genetic engineering in the mouse.

Link

Noot: ik ben maar een simpele psycholoog die weinig kaas heeft gegeten van DNA. Ik ben al blij als ik het principe snap. Toch al bedankt voor de reacties

Dan is het misschien wel goed om iets uit te leggen over DNA voordat we bij het proces van recombinatie uitkomen.

In elke cel van je lichaam bevindt zich het DNA ( de drager van erfelijke code). DNA is een lange keten van nucleotiden. En DNA komt normaliter in tweevoud voor (de dubbele DNA helix die je vaak in tekst boeken ziet).

zie de volgende link voor een afbeelding van deze helix:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.f...ryer.figgrp.146

Bij elke celdeling wordt een copy gemaakt van het DNA, want de twee resulterende cellen moeten allebei een copy van het erfelijke materiaal hebben. Om dit mogelijk te maken moet de twee strengen van de DNA helix uit elkaar gehaald worden. Vervolgens moet er een copy van gemaakt worden zodat er 4 strengen zijn. Tenslotte moeten er twee strengen met elkaar verbonden worden voor een DNA helix, zodat er twee keer dezelfde DNA helix is. Deze twee DNA helixen worden verdeeld tussen de twee cellen die uit de celdeling voortkomen.

Dit gaat vaak goed, maar 1 keer in de zoveel tijd gaat dat niet goed. Hierbij treedt er een breuk in de DNA strengen op en wordt bij het herstel de twee strengen verwisseld. Dit natuurlijke proces heet recombinatie. Het is belangrijk dat dit proces duidelijk is voordat ik de rest uit kan leggen.

zie de volgende link voor een schematische weergave van recombinatie:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.f...iga.figgrp.3249

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen

Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen

Re: Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen

Re: Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen

Re: Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen

Re: Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen

Re: Gerichte homologe recombinatie bij transgene muizen