Springen naar inhoud

restrictie-enzymen en BSA


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 26 september 2006 - 10:15

Hoe kan BSA de stabiliteit van een restrictie-enzym verhogen?
"Meep meep meep." Beaker

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Dalton

    Dalton


  • >250 berichten
  • 808 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 15:36

Puur door aanwezig te zijn.
Volgens mij is de echte verklaring nog niet bewezen en wordt er alleen maar naar gegokt. Ik ken twee mogelijkheden die het verklaren.

De belangrijkste is coaten.
Eiwitten hebben de nare eigenschap dat ze overal aan binden, echt overal dus ook aan je epje. Zelfs aan speciale non-stick epjes.
Bij hoge concentraties is dit bijna verwaarloosbaar, maar bij lage concentraties zoals de meeste enzymreacties is dit alles behalve verwaarloosbaar. Zeker bij 37 graden.
BSA zorgt voor een hoger totaal eiwit concentratie zodat er minder plek overblijft voor je enzym aan de rand van het epje.

Ik werk zelf erg veel met enzymreacties en zonder iets stabiliserends erbij is al het eiwit zo verdwenen, na 5 dagen 37 graden was het bijna compleet weg.
Met BSA of iets anders erbij bleef het meeste aanwezig.
Natuurlijk varieerd dit heel erg per eiwit en concentratie.

De tweede verklaring is door de volume van het BSA. Doordat er veel BSA aanwezig is, is er minder ruimte over voor enzym en substraat waardoor ze elkaar makkelijker vinden.


Zelf heb ik een paar maanden geleden nog getest wat de invloed van BSA is in een nieuwe assay die ik had opgezet. Het ging hier om een 5-tal opeenvolgende enzymreacties in 1 reactie. Met BSA deed ie het een stuk beter totdat je boven 0,5% kwam, vanaf daar bleef de activiteit hetzelfde.
Met toevoeging van Tween-20 (emulgator, zeepachtig) deed de reactie het zelfs nog beter dan met BSA. Een zeep voorkomt dat je eiwit aan de wand plakt dus zou je denken dat de eerste verklaring de ware is.
Maar het blijft gis werk.

#3

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 28 september 2006 - 08:46

Heel interessant, zit wel enige logica achter :)

Heb je misschien nog (gepubliceerde) experimentele resultaten die ik zou kunnen/ mogen verwerken. :)
"Meep meep meep." Beaker

#4

Bartsel

    Bartsel


  • >100 berichten
  • 196 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 september 2006 - 20:11

Dit is een onmogelijke googleopdracht. Ik heb geen idee. voorkoming van adsorptie, wegvangen van proteinase-activiteit, ik kan er duizend-en-een verklaring voor verzinnen maar geen tref ik op google als de juiste aan.

Net zoiets als DMSO in een PCR: die werkt daadoor bijna altijd, ongeacht de moelijkheden voor het toevoegen van DMSO. Een probaat wondermiddel. Maar heeft iemand van jullie hier een verklaring voor? Niemand die ik het vroeg had een beter argument dan dat PCRs nu eenmaal beter werken met DMSO erbij.

Hm. Er bestaat een hoop abacadabra in de natte biochemie.
"Pfff... Facts. You can prove anything with facts" -
Homer Simpson

#5

Dalton

    Dalton


  • >250 berichten
  • 808 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 september 2006 - 23:07

@Bartsel

Grappig,
Vanmiddag was een meisje bij ons op het lab op zoek naar DMSO voor een PCR.
Dit was de allereerste keer dat ik dit gehoord had en dezelfde dag begin jij er ook over. Uiteraard vroeg ik wat het doet in een PCR, ik wil altijd weten wat alles stofjes overal doen. Maar niemand wist het, het enige antwoord dat ik kreeg was dat het hielp bij de annealing van primers.

@Wouter
De bepaling waar ik het over heb is deze:
http://www.ncbi.nlm....st kinetic tafi
Deze bepaling heb ik in Amsterdam opgezet met een aantal aanpassingen.
De resultaten van BSA/ tween zullen nooit gepubliceerd worden.
Dat was een gewoon een optimalisatie stap die waarschijnlijk een impact factor van -4 zou krijgen.
Resulaten wil ik je wel geven maar meer dan een paar cijfers (mOD/min) zou het niet zijn.
Misschien kan ik wel een SDS-PAGE gel scan vinden waar mooi op te zien is dat het verdwijnd.
Wat zou je precies willen hebben?

#6

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 02 oktober 2006 - 08:04

Wat cijfers zijn altijd fijn. Tevens is een SDS-page scan altijd mooi. Ik stuur je wel even een pb.

EDIT: Ik heb trouwens altijd begrepen dat DMSO de self-annealing van sDNA tegen gaat waardoor de primers beter kunnen hechten. Deze structuur is te onderzoeken met mfold (moet je maar even googlen naar de exacte site). Deze bepaling is direct op het internet uit te voeren, hiervoor hoef je niks te downloaden.

Bij een Real-Time PCR moet je dan ook oppassen met het toevoegen van DMSO wanneer je gebruik maakt van molecular probes. Je kan dan een fout positief resultaat krijgen.
"Meep meep meep." Beaker





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures