Springen naar inhoud

Taq polymerase produceren


  • Log in om te kunnen reageren

#1

JoNa's

    JoNa's


  • 0 - 25 berichten
  • 12 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 28 oktober 2006 - 14:16

Hoi iedereen,

Wij hebben jullie hulp nodig, het zit namelijk zo:
Wij moeten een eindproject doen als afsluiting voor onze opleiding laboratoriumonderwijs.
Wij hebben gekozen om Taq polymerase te produceren.
Het pTAQ gen halen we uit de bacterie Thermus Aquaticus. Dit transformeren wij in een E.coli pUC 18.

Wij willen onze verschillende stappen controleren met behulp van een gelelectroforese. Deze gelelectroforese voeren wij uit met pUC 18, het losse pTAQ gen en pUC 18 met het ingebouwde gen. We hebben hierbij nog een ladder/marker nodig, maar dit hebben wij niet kunnen vinden.
Weten jullie misschien waar we dit soort informatie kunnen vinden?

Op het eind willen wij ons product controleren met behulp van een eiwitgel. Ook hierbij hebben we een ladder/marker nodig. Kunnen jullie ons misschien helpen om dit te vinden?

Wij willen het pTAQ gen amplificeren met de PCR. Hierbij gebruiken wij chromosomaal DNA van de Thermus Aquaticus als template. Wij hebben alleen geen idee wat voor PCR programma we hiervoor kunnen gebruiken. Elke hulp hierbij zal zeer gewaardeerd worden.

Als jullie nog tips of extra informatie hebben, zou dat erg welkom zijn.
Alvast bedankt.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8248 berichten
  • VIP

Geplaatst op 28 oktober 2006 - 19:39

Vooraf wil ik je waarschuwen: Taq polymerase is vreemdgenoeg gepatenteerd. Hoewel je waarschijnlijk geen problemen hiermee zal krijgen zolang je dit niet gaat verkopen, wil ik je hier voor de zekerheid toch even voor waarschuwen.

Vervolgens: een geschikte DNA ladder om je RFLP PCR (dat wil je toch doen?) te controleren. Dit hoeft niet zo moelijk te zijn. Wanneer je de fragment lengte van je pUC 18 weet en van pTAQ, dan moet je kijken naar een ladder waarvan deze fragmenten in zijn bereik liggen. een 200 bp of 500 bp ladder zou denk ik wel moeten kunnen werken. Laat desnoods 2 verschillende ladders naast elkaar runnen.

Als je het pTAQ gen wilt amplificeren, dan zal je hiervoor specifieke primers moeten ontwikkelen. Je zal de Tm van je PCR programma zo in moeten stellen dat deze (waarschijnlijk) 2 graden onder laagste smelttemperatuur van je primers ligt. Taq polymerase kan ongeveer 1000 bp/minuut amplificeren. Als je weet hoe groot je sequentie is van je PCR product dan weet je ook wat de optimale tijd voor je Tm is.

Vervolgens zal je experimenteel moeten bepalen wat de optimale [MgCl2] is.

Het zal er in de praktijk op neer komen dat je een aantal PCR's moet draaien waarbij je een Tm gradiŽnt in zet tesamen met een aantal verschillende [MgCl2].

Als ik dan even een voorbeeldje maar waar je zeker mee van de grond moet komen dan kom ik op het volgende uit:

cyclus 1:       95 graden        4 minuten

cyclus 2:       95 graden       30 seconden

(30 a 40 x)    50-60 graden  30 seconden

                   72 graden        1 minuut (of afhankelijk van je fragment lengte)

cyclus 3:      72 graden        7 minuten

cyclus 4:     15 graden         oneindig (om overnacht te bewaren bijvoorbeeld)





Vervolgens zet je alle monster na PCR op een agarose gel en kijk je wat het dikste PCR product oplevert, maar waarbij je geen DNA smeer door aspecifieke primer binding kan vinden.
"Meep meep meep." Beaker

#3

JoNa's

    JoNa's


  • 0 - 25 berichten
  • 12 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 30 oktober 2006 - 19:35

Hoi,

Bedankt voor het beatwoorden van onze vragen.

Dit project is een afstudeer project, we zijn dus niet verplan om de geproduceerde taq polymerase te verkopen. Dus maak je maar geen zorgen :) .

Het lijkt mij ook een goed idee om 2 ladders naast elkaar te laten lopen.

We zullen ook even bekijken hoe we het precies gaan doen met de Tm van de PCR programma. Om meerdere cyclussen te doen en daarna een gelelectroforse neemt te veel tijd in beslag. We hebben maar een aantal dagen om het hele experiment te doen.

Bedankt voor je tips.

Groetjes

P.S. extra informatie of tips zijn altijd welkom!

#4

Archeopteryx

    Archeopteryx


  • >250 berichten
  • 590 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 30 oktober 2006 - 19:41

Wel handig om je eigen Taq polymerase te produceren, ik heb eens uitgerekend wat dat spul kost dat wij gebruiken, 1,2 miljoen euro per liter :)

#5

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8248 berichten
  • VIP

Geplaatst op 30 oktober 2006 - 19:48

Taq polymerase is inderdaad zeer prijzig.

Ik wil je niet ontmoedigen, maar om een PCR goed lopend te krijgen kan je rustig 2 dagen bezig zijn.

Je zal altijd meerdere cycli uit moeten voeren anders heb je gewoon geen volledige PCR gedaan. Denaturatie, aanhechten en elongatie zijn de basisstappen die je hoe dan ook uit moet voeren. Tevens moet je cyclus 2 30 ŗ 40 keer uitvoeren om een voldoende hoeveelheid PCR product te krijgen. Om te controleren moet je ook je PCR product op agarose gel zetten en electrofereren.

Het lijkt me alsof je een paar basisprincipes mist betreffende PCR. Typ eens neer wat je precies wilt gaan doen, stap voor stap. Dan kunnen we je misschien nog bij sturen.

Heb je ook rekening gehouden met je readingframe? Welke resistentie ga je trouwens gebruiken? Ampicilline, Penicilline?
"Meep meep meep." Beaker

#6

JoNa's

    JoNa's


  • 0 - 25 berichten
  • 12 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 31 oktober 2006 - 17:20

We zijn verplan om eerst:
- pUC 18 te isoleren uit E.coli JM109 (= resistent tegen ampicilline) daarna:
- Zuivering van het plasmide DNA puc 18 met een QIAprep Spin Miniprep
- Het chromosomaal DNA isoleren uit de Thermus aquaticus bacterie
- Het chromosomaal DNA vermenigvuldigen met een PCR en gelijk 2 restrictiesites inbouwen
- PCR product zuiveren met een PCR purification kit
- open knippen van de pUC 18
- het verwijderen van de taq gen uit het chromosomaal DNA
- taq gen in pUC 18 plakken
- controle door gelectroforese -> 3 dingen:
1. pUC 18 met het ingebouwde taq gen
2. het losse taq gen (na de PCR)
3. "gewone" pUC 18

- taq gen in pUC 18 in competente cellen zetten
- op het laatst als er tijd over is moeten we het product controleren en dit willen wij misschien met een eiwitgel doen. Maar hier zijn wij het nog niet helemaal over eens.

Dit is dus de hoofdlijnen van ons project.
Heb je er veel aan?? of moet ik extra informatie geven over een bepaald onderdeel?

Groetjes

#7

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8248 berichten
  • VIP

Geplaatst op 31 oktober 2006 - 19:10

De hoofdlijnen klinken goed, Houd je wel rekening met de gekozen restrictie sites. Zodoende dat je geen autoligatie krijgt (kies dus voor 2 verschillende stiky ends)

Probeer ook nog een negatieve controle te verzinnen van je competente cellen. Nu zou het kunnen zijn dat wanneer er autoligatie op treed, dat je dan te maken krijgt met een plasmide met ampicilline resistentie, maar zonder het pTAQ gen.

Let je op je reading frame en transcriptie factoren?

Het eiwit is te controleren via een blot. Je zou ook kunnen proberen om met een ionenwisselaar je Taq polymerase te zuiveren en met een PCR kijken of deze werkt. Dit is echter nogal arbeidsintensief en daar heb je denk ik de tijd niet voor. Het opkweken en zuiveren en testen van Taq polymerase duurt al zeker vier dagen. Echter dit zal je moeten doen als je Taq polymerase wilt produceren zoals je in je openingspost verteld. Denk eens goed over je planning na, je zal waarschijnlijk gruwelijk in tijdsnood komen.
"Meep meep meep." Beaker

#8

JoNa's

    JoNa's


  • 0 - 25 berichten
  • 12 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 31 oktober 2006 - 19:29

He,

Bedankt voor je tips!

We zullen het allemaal rusig bespreken.
Ik hou je wel op de hoogte van onze beslissingen.

Ow, er is een lab. jaarbeurs in Utrecht.
Ben je er al heen geweest?

Groetjes

#9

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8248 berichten
  • VIP

Geplaatst op 31 oktober 2006 - 22:58

Nee daar ben ik niet geweest. Zit momenteel in het derde jaar van het HLO, dus volgens mij heb ik daar niet zoveel te zoeken. (Heb ik trouwens ook helemaal geen tijd voor maar dat terzijde)

Zullen we verder proberen om het hier een beetje on-topic te houden.
"Meep meep meep." Beaker

#10

JoNa's

    JoNa's


  • 0 - 25 berichten
  • 12 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 01 november 2006 - 17:29

Ok, Sorry :)

#11

WendyTje

    WendyTje


  • >250 berichten
  • 773 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 02 november 2006 - 11:47

We zijn verplan om eerst:
- pUC 18 te isoleren uit E.coli JM109  (= resistent tegen ampicilline)   daarna:
- Zuivering van het plasmide DNA puc 18 met een QIAprep Spin Miniprep
- Het chromosomaal DNA isoleren uit de Thermus aquaticus bacterie
- Het chromosomaal DNA vermenigvuldigen met een PCR en gelijk 2 restrictiesites inbouwen
- PCR product zuiveren met een PCR purification kit
- open knippen van de pUC 18
- het verwijderen van de taq gen uit het chromosomaal DNA
- taq gen in pUC 18 plakken
- controle door gelectroforese -> 3 dingen:  
1. pUC 18 met het ingebouwde taq gen
2. het losse taq gen (na de PCR)
3. "gewone" pUC 18

- taq gen in pUC 18 in competente cellen zetten
- op het laatst als er tijd over is moeten we het product controleren en dit willen wij misschien met een eiwitgel doen. Maar hier zijn wij het nog niet helemaal over eens.

Dit is dus de hoofdlijnen van ons project.
Heb je er veel aan?? of moet ik extra informatie geven over een bepaald onderdeel?

Groetjes


en daar heb je een paar dagen voor? good luck!! daar ben je volgens mij wel een maand mee bezig, zeker omdat je nog niet veel labwerk in de vingers hebt.

Ook snap ik niet helemaal dat je je PCR met niet zoveel cycli wil doen: dan heb je dus gewoon geen opbrengst!! een PCR duurt een paar uur, daar kom je niet onderuit, checken met electroforese kost een uurtje extra en lijkt mij een hele essentiele stap

Maar je oorspronkelijke vraag was naar markers/ladders: ga eens kijken op de sites van invitrogen en sigma, die hebben er tientallen, zowel voor DNA als eiwit.
To boldly go where I`ve never been before

Be nice to nerds, chances are you`ll end up working for one

#12

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8248 berichten
  • VIP

Geplaatst op 03 november 2006 - 09:13

Nog een tip (als je het allemaal binnen de tijd gedaan krijgt wat me onwaarschijnlijk lijkt), je kan controleren of je Taq polymerase de goede concentratie heeft via verschillende technieken. Een qPCR behoort tot de mogelijkheden (dan moet je wel eerst de concentratie van je begin DNA weten. Dit kan je dan weer fotospectrometrisch bepalen. 260 nm, 280 nm en 350 nm). Je kan ook ipv een qPCR een gewone PCR uitvoeren en deze dan op agarose gel zetten. de dikte van de bandjes kan je verelijken met de dikte van je DNA ladder om zo de concentratie te bepalen.
"Meep meep meep." Beaker

#13

Benm

    Benm


  • >5k berichten
  • 8801 berichten
  • VIP

Geplaatst op 03 november 2006 - 09:50

Het lijkt mij ook nogal veel om in een paar dagen te doen.

Als je het al 100x gedaan hebt en alles gaat in 1x goed, dan kan dat wellicht, maar als een van je eerste experimenten van dit soort?
Victory through technology

#14

JoNa's

    JoNa's


  • 0 - 25 berichten
  • 12 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 04 november 2006 - 13:46

Even ter verduidelijking: Wij zijn van plan om 1 keer een PCR uit te voeren van meer dan 30 cycli. Dus onze opbrengst is dan voldoende.

Alle labhandelingen hebben wij al meerdere keren uitgevoerd, dit zal dus niet veel problemen opleveren. Dit is alleen de eerste keer dat wij zelf de ladders, PCR programma etc. moeten uitzoeken.

Doordat we zo weinig tijd hebben zijn we niet van plan de concentratie van de Taq polymerase te bepalen. Het project hoeft ook niet compleet afgemaakt te worden. Er word voor de beoordeling ook gelet op samenwerking en het afhandelen van ontstane problemen enz.

WendyTje, Dankjewel voor je tips. We hebben de juiste ladders gevonden op de site van invitrogen.


Wouter_Masselink, Wij houden wel degelijk rekening met de readingframe en transcriptiefactoren. We zorgen voor verschillende controles.

Hartelijk bedankt voor jullie tips en informatie. We komen er nu wel uit.

Groetjes





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures