Springen naar inhoud

Bloed


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Dreeke

    Dreeke


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2007 - 19:47

hallo

ff voorstellen : Ik ben Andreas en studeer momenteel Biotechnische wetenschappen (6de middelbaar). Zoals iedereen in het 6de moeten we ook een eindwerk maken. Mijn eindwerk gaat over bloed (momenteel zijn we bezig met het praktische gedeelte)

Mijn vraag / probleem :

Een goei week geleden ben ik bloed in het slachthuis gaan halen, dit heb ik ingevroren. Na het ontdooien was het bloed terug vloeibaar. Tijdens LABO was ik van plan om het bloed te centrifugeren, maar dit lukte niet. niet in een gewone centrifuge en niet in een minicentrifuge ( vorige keer met vers bloed lukte dit wel )

1. het mislukken van het centrifugeren kan dit te maken hebben met het invriezen ??
daarnet heb ik met de 'zoek-functie' gelezen dat je best eerst het bloed centrifugeerd dan invriest ... ik hoop dat dit niet waar is :)

2. moest het nu zo zijn dat centrifugeren niet meer lukt, kan ik dan geen stof toevoegen die de bloedcellen en lichaampjes laat neerslagen ofzo ?

3. bestaat er ook een stof die bepaalde onderdelen doet kleuren, bv lichaampjes, bloedcellen, de stollingsdraden, ... ?

alvast bedankt
Dreeke

(ik heb, voor ik dit poste, al enkele keren op google gezocht maar niets gevonden)

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

lucifer

    lucifer


  • >100 berichten
  • 146 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 19 februari 2007 - 00:15

Ik moet, je denk ik teleurstellen. Maar als je bloed invriest dan gaan alle rode bloedcellen stuk. Leg maar eens een druppeltje onder de microscoop, je zult zien dat er geen cellen meer te zien zijn. Een manier om de cellen neer te laten slaan is er dus niet. Dit is ook de reden dat alle metingen in een hematologisch laboratorium gelijk moeten gebeuren en niet al te lang uitgesteld kunnen worden.

De enige manier om bloed in te vriezen is eerst alle cellen te verwijderen door het te centrifugeren en het plasma of serum in een apart buisje te stoppen.

Een manier om bloed te kleuren is bijvoorbeeld de May Grünwald Giemsa kleuring. Bij deze manier maak je eerst een bloeduitstrijkje en die kleur je dan volgens bovenstaande methode. Hierbij zijn dan alle cellen gekleurd.
Adde parvum parvo magnus acervus erit.

#3

Dreeke

    Dreeke


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 19 februari 2007 - 09:34

bedankt lucifer !

de May Grünwald Giemsa kleuring werkt dan ook niet bij het ingevroren bloed aangezien de bloedcellen weg zijn ?

zou ik met dat ingevroren bloed nog enkele proeven kunnen doen, of ben ik daar niets meer mee ?

#4

lucifer

    lucifer


  • >100 berichten
  • 146 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 19 februari 2007 - 12:28

Om daar antwoord op te kunnen geven moet ik eigelijk iets meer weten van het lab dat je tot je beschikking hebt. Je zou bijvoorbeeld een hemoglobinebepaling kunnen doen, dat gaat prima met gelyseerd bloed. Een totaal eiwit bepaling is ook een redelijk eenvoudig proefje, maar nogmaals ik weet niet welke middelen je tot je beschikking hebt.
Adde parvum parvo magnus acervus erit.

#5

Dreeke

    Dreeke


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 19 februari 2007 - 12:54

qua stoffen is er vrij veel aanwezig en qua apparatuur het hoofd noodzakelijke, dit weet ik niet allemaal vanbuiten ...

wat heb ik dan precies allemaal nodig ??

#6

Dreeke

    Dreeke


  • 0 - 25 berichten
  • 4 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 28 februari 2007 - 13:55

hoe gaat die hemoglobinebepaling juist in zijn werk ? en die totaal eiwit bepaling ?

ik vind hier bijna niets over op google [rr]

#7

lucifer

    lucifer


  • >100 berichten
  • 146 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 februari 2007 - 20:56

Na lang zoeken kwam ik mijn oude praktijkvoorschriften tegen....

Totaal eiwit:

Biureetreagens:
32 mmol/l KNatartraat
12 mmol/l CuSO4
30 mmol/l KI
200 mmol/l NaOH

Verder heb je een oplossing nodig met een bekende eiwitoplossing die als standaard dient

Werkwijze:
voeg 5,0 ml biureetreagens en 0,1 ml plasma samen. Meng en laat een half uur staan bij kamertemperatuur.

Lees af op een spectrofotometer bij 545 nm t.o.v. demiwater

Nu kan je de concentratie uitrekenen door (extmonster*conc.standaard)/extstandaard

Over de werking van deze analysetechniek wil ik je graag verwijzen naar de wet van lambert beer
Adde parvum parvo magnus acervus erit.

#8

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 28 februari 2007 - 21:11

Naast biureet wordt ook vaak gebruik gemaakt van coomassie brilliant blue G-250. De biureet methode is hetzelfde als de zogenaamde 'lowry assay'. Dit is goed in een 96 wells microtiter plaat uit te voeren. Ik zou je wel aan willen raden om een callibratie curve te maken en te gebruiken.
"Meep meep meep." Beaker

#9

lucifer

    lucifer


  • >100 berichten
  • 146 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 februari 2007 - 21:20

heb je op zich gelijk in, maar omdat het een eindwerk van de middelbare school betreft leek het mij nauwkeurig genoeg om het op 1 standaard uit te rekenen.

edit: uiteraard moet dan wel alles minimaal in duplo gebeuren, liefst triplo
Adde parvum parvo magnus acervus erit.

#10

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 28 februari 2007 - 21:28

edit: uiteraard moet dan wel alles minimaal in duplo gebeuren, liefst triplo


Als je een 96 wells plaat gebruikt is het kinderlijk eenvoudig om met een multichannel pipet een heelveel-voud uit te voeren. Correct met een multi-channel pipet werken vergt echter wat ervaring. Tevens moet je de beschikking hebben over een multichannel pipet (of andere duimdruk pipetten) en een plaat reader.

Zelf heb ik ervaren dat een lowry met grote vollumes lang niet zo goede resultaten geeft als de microtiter plaat variant.

Het probleem wanneer er 1 standaard wordt gebruikt is dat de concentratie mogelijk niet in het lineaire gebied wordt gekozen.
"Meep meep meep." Beaker

#11

lucifer

    lucifer


  • >100 berichten
  • 146 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 februari 2007 - 21:43

Het probleem wanneer er 1 standaard wordt gebruikt is dat de concentratie mogelijk niet in het lineaire gebied wordt gekozen.

Daar heb je een punt.

Verder is het werken met een 96 wells plaat voor de meeste schoollaboratoria geen doen, puur en alleen omdat de spullen niet aanwezig zijn. Vandaar dat ik ook aankwam met een voorschrift waarmee je met lekkere grote volumes aan het werk bent.
Adde parvum parvo magnus acervus erit.

#12

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 28 februari 2007 - 23:13

Ik heb hier toevallig ook nog een protocol liggen om een biureet bepaling uit te voeren. Hierbij wordt een BSA stock van 10 mg BSA/mL in 0,9 m/m % NaCl om een callibratie reeks op te stellen van 0, 2, 4, 6, 8 en 10 mg BSA/mL in 0,9 % NaCl. Als je je concentratie van je standaard kiest op 5 mg BSA/mL in 0,9% NaCl, dan zou het goed moeten gaan.

Let wel op dat elk eiwit anders reageert op een reagens. Biureet reagens is vrij ongevoelig voor de soort binding waar het meer reageert, zijnde een peptidebinding. Echter reagentia zoals NH4+, Tris en Good's buffers kunnen de reactie verstoren.

In de bradford assay (maakt gebruik van Commassie brilliant blue) zal er alleen een reactie worden aangegaan met aromatische en zure groepen van de aminozuren. De reactie kan per eiwit dus iets verschillen. Als callibratie gebruikt men echter altijd BSA (Bovine Serum Albumine) als callibratie reeks en neemt de fout die kan ontstaan voor lief. Reagens die de Bradford assay kunnen verstoren zijn Triton X-100 en SDS.

In mijn vorige posting heb ik een fout gemaakt. Hierin zei ik dat de Lowry assay gebruik maakt van CoomassieBriliant blue, dit klopt niet. De lowry assay is hetzelfde als de biureet methode, echter er is dan ook nog Folin-ciocalteau reagens aan toegevoegd. (Lowry et al. 1951; Hartree 1972)

Naast deze fluorimetrische methoden kan je ook een spectrofotometrische methode overwegen. Bijvoorbeeld de 260/280 methode (Layne 1957) zijnde:

Ceiwit [mg * mL-1] = 1,55*A280nm - 0,76*A260nm.

Als grotere sensitiviteit nodig is kan je de methode van Groves (Groves et al. 1968) gebruiken.

Ceiwit [mg * mL-1] = (A224nm - A233,3)/5,01

De edelhoch methode (Pace et al. 1995) is te gebruiken wanneer de exacte aminozuur samenstelling van het eiwit bekend is. Het spreekt dan ook voor zich dat je hier niet met een complexe samenstelling van verschillende eiwitten moet werken, zoals in dit specifieke geval.
"Meep meep meep." Beaker





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures