Dna-fingerprinting via pcr

Danio Rerio

Zou iemand me aub het principe van DNA-fingerprinting via Polymerase Chain Reaction willen uitleggen?

Ik heb begrepen dat dit iets te maken heeft met een aantal tandem arrays in je genen die bij elk individu verschillend zijn. Men zou grote kopieën van een DNA-staal kunnen maken en deze knippen met een bepaald restrictie-enzyme? Om nadien de bekomen fragmenten te scheiden dmv electroforese, waarbij elk individu een verschillend bandenpatroon geeft omwille van de verschillende lengten van tandem repeats.

Wouter_Masselink

Je legt het zelf al precies goed uit. Wat snap je hier niet aan?

Danio Rerio

Wel ja, ik denk dat mijn redenering ergens blijft steken in het verband tussen verschillende lengten van tandem repeats & verschillende restrictiefragmenten.

Kan zo'n restrictieenzyme niet knippen 'binnen' een tandem repeat?

Knipt het net buiten de randjes van zo n tandem repeqt ?

En kan ie+and me zeggen hoe je op deze website querty uitschqkeld en azerty aan

Puzemuze

Dat is juist het mooie aan het hele systeem, alles wordt op willekeurige grootte geknipt. Als je dus een stuk met ACGTTGAAU hebt kun alle volgende stukjes krijgen van A tot ACGTTGAAU. Je moet namelijk wel een startsequentie hebben, zodat je vanaf een vast punt begint. En door die fragmenten met elektroforese te scheiden krijg je de hele sequentie, omdat alle stukjes steeds één nucleotide van elkaar verschillen.

(op de een of andere manier heb ik het gevoel dat ik dingen door elkaar haal, maar volgens mij komt het hier wel op neer!)

WendyTje

Dat klopt niet helemaal puzemuze. Ik denk dat je ergens een klok hebt horen luiden over sequencing ofzo.. wat hier dus niet van toepassing is!!

De meeste restrictieenzymen knippen allesbehalve random, ze hebben een vaste seqentie en alleen daar kunnen ze knippen, bijvoorbeeld alleen in CATG, nou komt dat maar eens in de zoveel keer voor in het DNA, en zijn bij sommige mensen de stukken daartussen groter dan bij anderen. Bij sommige mensen is dus het tandem repeat groter/anders/kleiner, en bij de ene zit daar geen restrictie fragment in (groter ongeknipt stuk) en bij anderen misschien weer wel (meerdere kleinere banden). Dit heeft tot gevolg dat de lengte van de stukken die overblijven voor ieder mens ietsje verschillen (dat is dan wel afhankelijk van je restrictie enzym, en je moet wel een goede kiezen, sommige knippen extreem veel en anderen bijna niets, maar daar zijn bepaalde mixen voor.) Als je dit DNA vervolgens op een electroforese gel runt (die scheidt op grootte) krijg je het specifieke bandenpatroon.

Voordat je dit alles gaat doen moet je het DNA eerst amplificeren (vermenigvuldigen) dmv een PCR reactie. Dat stuk snap je wel?

Puzemuze

Ik heb het even opgezocht, en ik heb het inderdaad verward met Cycle Sequencing!

Nouja, kan gebeuren he..

Wat ik bedoelde met willekeurig bij de restrictie-enzymen: het is niet dat ze alléén maar de eerste ACT (ofzo) van een DNA-molecuul knippen, maar dat het dus ook de 15e in de reeks kan zijn. En dan had ik in mijn hoofd dat er een boel verschillende restrictie-enzymen worden ingegooid, door de verwarring met het sequencen. Achja..

Danio Rerio

Wat ik eigenlijk nog wou weten over die PCR-techniek..

Telkens je een cyclus doorloopt, wordt het stuk DNA waarbij je oorspronkelijk begonnen bent een beetje ingekort, omdat je primers gebruikt die achteraf verwijderd worden. Klopt dit? En ga je dan na 30 cycli ofzo niet eindigen met een stompje DNA waar je helemaal niets meer mee kunt aanvangen?

Wat betreft de fingerprinting, ik denk dat ik het nu begrijp, bedankt!

WendyTje

De primers worden helemaal niet verwijderd, die blijven gewoon lekker ingebouwd, dus al het product heeft dezelfde lengte, op een gel is het dan ook (bij 1 specifieke primerset) maar 1 band. Je stopt dus genoeg primer in je mix zodat dit proces gewoon door kan gaan, zal je de runs extreem lang herhalen stopt het proces op een gegeven moment omdat of de dNTPs (meestal) of de primers op zijn.

Stel dat ze er wel afgehaalt zouden kunnen worden, en het korter zou worden, dan kunnen in de volgende run er toch geen primers meer hechten? omdat hun specifieke sequentie dan weg is. Dan zou de hele PCR niet meer verlopen. Ook de (meeste) primers zijn heel erg specifiek voor een sequentie.

Als je een pool (onbekend) DNA wil amplificeren, dan gebruik je "random primers", dat is een set van meerdere sequenties/primers, en minder specifiek voor maar 1 stuk, en ze vormen ook verschillende Forward/Reverse combi`s. Maar ook deze blijven lekker ingebouwd zitten, alleen hier amplificeer je "random" stukken en krijg je dus daarom verschillende lengtes.

Wouter_Masselink

Danio Rerio schreef:Wat ik eigenlijk nog wou weten over die PCR-techniek..

Telkens je een cyclus doorloopt, wordt het stuk DNA waarbij je oorspronkelijk begonnen bent een beetje ingekort, omdat je primers gebruikt die achteraf verwijderd worden. Klopt dit? En ga je dan na 30 cycli ofzo niet eindigen met een stompje DNA waar je helemaal niets meer mee kunt aanvangen?

Wat betreft de fingerprinting, ik denk dat ik het nu begrijp, bedankt!

De primers worden helemaal niet verwijderd, die blijven gewoon lekker ingebouwd, dus al het product heeft dezelfde lengte, op een gel is het dan ook (bij 1 specifieke primerset) maar 1 band. Je stopt dus genoeg primer in je mix zodat dit proces gewoon door kan gaan, zal je de runs extreem lang herhalen stopt het proces op een gegeven moment omdat of de dNTPs (meestal) of de primers op zijn.

WendyTje heeft zoals gewoonlijk gelijk. Als ik het goed zie verwar je een PCR met de DNA amplificatie in vivo. Hierbij zijn inderdaad telomeren en de bekende okazaki fragmenten bij betrokken.

WendyTje

WendyTje heeft zoals gewoonlijk gelijk.

THX! Gek genoeg krijg ik dat nou bijna nooit te horen irl!

(jaa, I know.. off topic, excuses)

qrnlk

http://openwetware.org/wiki/PCR

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Dna-fingerprinting via pcr

Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr

Re: Dna-fingerprinting via pcr