Springen naar inhoud

[biologie] toxiciteitsbepaling mbv 96 wells platen.


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Zoeker

    Zoeker


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 17 februari 2008 - 21:14

Ik wil een aantal stoffen (elke stof apart) toevoegen aan MDCK-cellen. Het is van belang te weten wat de maximale concentratie is van die stoffen die deze MDCK cellen nog kunnen verdragen. Voor de definitieve testen ga ik dan een concentratie stoffen toevoegen die onder deze maximale concentratie liggen. In feite ben ik dus op zoek naar de toxische grenzen van deze stoffen voor MDCK cellen.

Daartoe heb ik een aantal van deze stoffen opgelost in ethanol absoluut en doorverdund met medium. Het uiteindelijke ethanol percentage was 40 volume%. In kolom 1 van een 96 wells plaat zijn terechtgekomen een aantal van deze (in 40% ethanol opgeloste) stoffen en deze zijn verder doorverdund door een deel te mengen met medium (en reeds gehechte cellen) aangebracht in alle wells van de rijen A t/m H.
Van elke stof was de beginconcentratie 1000Ķg/ml en de verdunningsfactor was 2 of 3 (afhankelijk van de specifieke stof). De gebruikte platen hadden condensatieringen.

Platen 24 uur in een stoof gezet (37įC , 5% CO2 en 90 RH) en toen de effecten bekeken en wat bleek tot mijn grote verbazing: alle welletjes vertonen toxische verschijnselen (cellen lieten allemaal los van de bodem, vormen conglomeraten en bollen sterk op). Ook de blanco rijen die gemaakt waren en bestonden uit gehechte cellen met alleen medium bleken toxisch geworden!!!

Ik ging er vanuit dat ik 96 onafhankelijke "bioreactoren" had gemaakt door deze opstelling te gebruiken. Maar blijkbaar wisselen de welletjes onderling dampen uit.
Is ook niet verwonderlijk want het deksel is gemeenschappelijk en sluit niet de welletjes hermetisch af. Beetje stom (?) om dit effect niet te voorzien.

Vraag 1: heeft iemand ervaring met dit effect? Voor mij was het eigenlijk nieuw. Niemand heeft mij ooit voor dit fenomeen gewaarschuwd. Dampspanning van het gebruikte oplosmiddel (in dit geval erg veel ethanol) zal een rol spelen?

Vraag 2: ik ga ook een reeks inzetten met caffeine, direct opgelost in medium. Beginconcentratie is 3884 Ķg/ml, verdunningsreeks wordt 2x. Zal de dampspanning van de inhoud van dit eerste welletje de andere welletjes beÔnvloeden?

Vraag 3: Is het mogelijk op ťťn plaat meerdere verschillende stoffen te testen ook als het oplosmiddel medium is? Elke stof zal een andere dampspanning creŽren ook al is het oplosmiddel hetzelfde?

Vraag 4: is zo'n toxiciteit "studie" Łberhaupt uit te voeren mbv 96 wells platen?



Wie heeft hier ervaring mee?

Arjen.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

WendyTje

    WendyTje


  • >250 berichten
  • 773 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2008 - 09:49

Weet je zeker dat het niet de opgeloste ethanol is die al toxisch is voor al je cellen? En als ik het goed begrijp neemt in je concentratiereeksje niet alleen de concentratie "te onderzoeken stof" af, maar ook de concentratie ethanol waar het in opgelost zit?

Hermetisch afsluiten lijkt me ook geen gezond plan voor je cellen want dan heeft die hele CO2 concentratie in de cel geen nut meer. Daarbij heb ik er nog nooit van gehoord dat het zo sterk gaat dampen en neerslaan in 96wells dat de welletjes onderling met elkaar besmet worden, dan zou je toch geen enkele proef meer kunnen doen?
To boldly go where I`ve never been before

Be nice to nerds, chances are you`ll end up working for one

#3

Zoeker

    Zoeker


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2008 - 15:26

In rij A van die 96 wells plaat heb ik doorverdund een opgelost stofje in 40% ethanol. Beginconcentratie van dat stofje was 1000 Ķg/ml. Het stofje zal inderdaad zijn opgelost in teveel ethanol (maar ik kreeg hem anders niet opgelost).

Maar de kwestie was: in rij B had ik een blanco, dus alleen aangehechte cellen met medium . De blanco diende om snel te kunnen vergelijken met rij A. Ook de cellen in de blanco gaan dood. Deze rij volgt in feite de rij A, waar de cellen in A er beter uit gaan zien (verderop in de verdunningsreeks) gaan de cellen van B er ook beter uit zien. Crosscontaminatie met pipetten oid. sluit ik uit, ik werk hardstikke netjes.

Gister nog een test uitgezet: 96 wells plaat met gehechte cellen (confluentie 30%) en medium. In de middels vier wellen (D6, D7, E6 en E7) het medium vervangen door ethanol 40%. Vanochtend resultaat bekeken: in een straal van 3 welletjes (vanuit middelpunt van genoemde 4 welletjes) zijn binnen 24 uur alle cellen los, opgebold en vormen conglomeren. Alleen in de uiterste 4 hoeken zie je cellen die het nog "doen" maar die beslist zijn aangetast.

Moet toch veroorzaakt worden door de ethanol?

Er worden inderdaad ontzettend veel testen gedaan met 96 wells platen maar zijn er "ongeschreven" spelregels zoals: de dampspanning van het oplosmiddel (in de breedste zin van het woord, dus ook water of medium) mogen onderling niet teveel afwijken ?

#4

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 08 maart 2008 - 09:00

Met deze cellijn (MDCK) heb ik geen ervaring, maar een regel is wel dat 40% ethanol toxisch is voor een eukaryote cel en dat gebruik je dus niet in je medium. Je test nu hoe toxisch 40% EtOH is voor je cel, niet je stofje X.
Je zal een andere manier van oplossen moeten verzinnen lijkt me.
Misschien in medium zonder serum, in een warm ultrasoon bad zetten/roeren overnacht/in een warmwaterbad/etc.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#5

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 11 maart 2008 - 02:14

40% EtOH lijkt me inderdaad ook toxisch voor eukaryote cellen. Verder vraag ik me af hoe je gaat bepalen of je toxisch effect hebt. Waar je precies naar op zoek bent is me onduidelijk. De lethale dosis of de dosis waarbij er een toxisch effect optreedt, vervolgens moet je dan toch echt afvragen hoe je dit wil gaan bepalen. De lethale dosis is vrij makkelijk te bepalen, celkweek 2 weken wegzetten, is er dan nog niks gegroeid dan weet je zeker dat er een lethaal effect is. Echter toxische effecten zijn al op zeer lage concentraties waar te nemen, denk hierbij aan verandering in expressie niveaus van een hele rits genen, verandering van proliferatie snelheid etc...

Probeer eerst je stof x op te lossen in je kweekmedium, mocht je dan nog niet het gewenste resultaat hebben, dan kan je nog altijd overstappen op lastigere manieren (zoals Mrtn zei, serum vrij ultrasoon etc.) Wees dan wel zeer op je hoede dat je geen precipitaat in je celkweek krijgt, dit kan zorgen voor plaatselijke concentratie verschillen en kan fysiek je cellen beinvloeden door middel van permeatie e.d.
"Meep meep meep." Beaker

#6

Zoeker

    Zoeker


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 18 maart 2008 - 19:33

Mrtn en Wouter,

hartelijk dank voor jullie reactie. Ik schaam mij een beetje nu pas te reageren, het seintje dat er nog een reactie kwam op mijn oproep liep via een niet veel gebruikt emailadres. Excuus.

Ik gebruik inmiddels 0,5% EtOH en verdun dan door met medium. Door meer tijd te nemen met dat doorverdunnen en in kleinere stappen en mbv ultrasoon lukt het mij oplossingen te maken in weinig EtOH.

De gebruikte oplossingen (met daarin een toegevoegd stofje) ga ik gebruiken om meer virus te induceren in MDCK-cellen. Maar ik moest de toxiciteitsgrenzen voor die stofjes eerst bepalen. Daarbij let ik vooral op sterk verminderde celgroei (tov een blanco), het loslaten van cellen, het opbollen, het vormen van conglomeraten etc. Dus in feite was ik op zoek naar de toxische grenzen (of de tolerantie) van die stofjes op MDCK-cellen.

Maar inmiddels heb ik die grenzen kunnen vinden en ga binnenkort met Influenzavirus aan de gang.

Nogmaals bedankt en jullie tips neem ik zeker mee. Na dit projectje komt er weer een tweede etc.

Groet, Arjen.

#7

Lala

    Lala


  • >1k berichten
  • 3149 berichten
  • VIP

Geplaatst op 18 maart 2008 - 22:23

MDCK zijn cellen uit hondennieren, waar een cellijn van is gemaakt. Met zoveel ethanol krijg je zelfs die cellen wel dood ja :P Normaal zijn die cellen vrij goed bestand tegen stress.
Appareo decet nihil munditia?





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures