Gentech

Pitchy

Enkele vb vragen naar aanleiding van het examen Gentechnologie. Soortgelijke vragen zullen op het examen worden gesteld, maar aangezien ik niet goed weet, hoe ik hieraan moet beginnen had ik graag jullie advies gehoord.

1. "Je beschikt over een DNA fragment. Uw opdracht bestaat erin dit fragment op een welbepaalde plaats te muteren. Als bacteriestam beschikt uw labo alleen over E. coli stammen die restrictie-negatief zijn, maar voor de rest wild type zijn. Wat lijkt u de aangewezen techniek om de mutatie uit te voeren. Verklaar uw antwoord."

2. "Je hebt de beschikking over een groot (>100 kb) plasmide waarop genX gelegen is. Daarnaast beschik je over een deletiemutant van het plasmide waarbij genX gedeleteerd is. Beschrijf een snelle benadering om genX op te sporen. Er zijn geen fenotypische eigenschappen van genX gekend."

3. " Je voert studie uit naar een recessieve erfelijke ziekte bij de mens. De oorzaak hiervan is

1 basenpaarverandering. De wijzigingen worden niet gekarakteriseerd door een verschuiving

in het restrictiepatroon. Beschrijf een methode om een drager van het mutante allel op te

sporen."

Bij vraag 1 had ik gedacht aan een mutagenese strategie, waarbij je gericht de mutatie steekt in een primer, waarmee je PCR uitvoert. Misschien is dit niet de meest geschikte methode?

Bij vraag 2 dacht ik aan een restrictiedigest, waarbij je bijde plasmiden verknipt met welbepaalde restrictie enzymen. Analyse achteraf op een agarose gel (of polyacrylamidegel?), geeft je een beeld of er een verschillend bandenpatroon ontstaat, wat bewijs is van mutatie, maar hoe kan je specifiek dit gen zelf opsporen?

Bij vraag 3 dacht ik dat je dit kon doen met SSCP (single strand conformation polymorphism). Je krijgt een verschil in mobiliteit van de te vergelijken enkelstrengen, wat zou wijzen op een basenpaarverandering. (stond zo in de cursus) Hoe is het eigenlijk mogelijk dat 1 bp verschil een significant verschil geeft op je gel? Wat heb je hiervoor nodig?

Alvast heel erg bedankt

WendyTje

1 en 2 lijken me oke, agarose gel is goed genoeg voor de meeste DNA toepassingen.

Bij 1: Ik weet niet precies wat ze bedoelen met E.colis die restrictie negatief zijn, kan er ook zo snel niet veel boeiends over googelen. Je kunt toch een miniprep doen (=DNA uit bacterie halen) dan muteren op de manier waarop jij wilt, en jouw aangepaste DNAtje, of je dat nou met knip, PCR, of gewoon volledig nieuw gesynthetiseerde strand doet, opnieuw in je bacterie transformeren? Maar oke, omdat de vraag zegt restrictie negatief, zou ik dus een antwoord zonder restrictie geven, al weet ik dus niet precies wat de consequenties zijn van een restrictie negatieve bacterie.

2: Tuurlijk kan. Hoewel restrictie natuurlijk niet het enige antwoord is. Ook bij vraag 2 kun je PCR gebruiken als je wat van de sequenties weet. (geen product = geen gen aanwezig, of verschil in product grootte)

Ook geeft een verschillend bandenpatroon natuurlijk al aan hoe groot het verschil is.

Als je (simpel gezegd) bij de ene bandjes krijgt van

1000, 800,200bp, en bij de andere bandjes van 1000, 900, 800, 400, 200 bp,

dan weet je dat je extra stuk, dus waarschijnlijk het gen 900+400 = 1300bp is, of dat klopt kun je vast wel ergens checken.

Uiteraard kun je ook altijd gaan sequencen, maar dat is een nogal omslachtige en wat duurdere methode voor iets wat je met knipjes of gewone PCR kunt doen.

3. kun je doen, heb ik zelf niet veel ervaring mee. Bij normale dubbel strands DNA fragmenten op gel kun je verschillen <10 bp inderdaad bijna niet zien, op grote stukken zijn verschillen van 100bp al lastig. Maar dat is dus met single strands anders, even van internet geplukt:

The mobility of double-stranded DNA in gel electrophoresis is dependent on strand size and length but is relatively independent of the particular nucleotide sequence. The mobility of single strands, however, is noticeably affected by very small changes in sequence, possibly one changed nucleotide out of several hundred. Small changes are noticeable because of the relatively unstable nature of single-stranded DNA; in the absence of a complementary strand, the single strand may experience intrastrand base pairing, resulting in loops and folds that give the single strand a unique 3D structure, regardless of its length. A single nucleotide change could dramatically affect the strand's mobility through a gel by altering the intrastrand base pairing and its resulting 3D conformation (Melcher, 2000).

Maar ook hier kan sequencing uitkomst bieden. Of een zeer specifieke QPCR met erg stringente probes.

Ik weet niet precies welke technieken je allemaal al kent, maar er zijn vaak vele wegen die naar rome gaan. Ga gewoon de meeste technieken die je kent na om te kijken wat je er eigenlijk allemaal mee kunt, je zult zien dat je voor de meeste dingen er meerdere kunt gebruiken.

ps: sorry voor het vele editen, mn layout deed niet wat ik wil, mn tab werkt dus blijkbaar niet dus ik ben daarmee aan het klooien...

Pitchy

Hartelijk dank Wendy!

1. Met restrictienegatieve E. colistammen bedoelt men, dat deze stammen je 'vreemd' binnenkomend DNA niet gaan verknippen. In de meeste Wild Type stammen (die restrictie positief zijn) zal dit binnenkomend materiaal als afweermechanisme verknipt worden.

Gericht aanbrengen van een specifieke mutatie is dit op meerdere manieren mogelijk? Als je in je DNA-fragment, slechts 1 basepaar wil veranderen, kan je dit dan alleen doen door mutatie in je primer te steken en deze dan via PCR te transformeren naar een ds (gemuteerd in beide strengen) DNA?

2. Als je dit inderdaad met restrictie enzymen doet, en het verschil in je bandjes nagaat, kan je dan met precisie bepalen waar het gen zich ergens bevindt?

3. Dankje voor je quote (vanop het internet). 'k Wist niet dat 1 bp verschil in ssDNA zo'n veel grotere inpact had in vergelijking met je dsDNA. Snap de redenering dat het wel degelijk met de instabiliteit heeft te maken van zo'n single chain, en het vormen van secundaire structuren (loops) en dergelijke meer.

De bedoeling is wel degelijk dat we dit trachten op te lossen met allerhande technieken die het snelste en goedkoopste zijn. Natuurlijk is het altijd het beste als je gans je fragment van interesse gaat sequeneren, maar dit is meestal meer werk, duurder, en je bekomt hetzelfde resultaat.

Nogmaals bedankt!

PS: Iemand die weet wat de techniek READS (Rapid Analysis of Differentially expressed Sequences) juist inhoudt? Staat in de cursus slechts het volgende over: "Techniek waarbij de geselcteerde, 3'-eindstandige fragmenten worden afgezonderd via restrictie-enzyme-afbraak en enkel deze reeks afgezonderde, discrete fragmenten worden geamplificeert met PCR." Vindt op internet geen bal hierover. Iemand die deze prehistorische techniek kent, weet waarvoor het gebruikt wordt of gewoon al eens van gehoord heeft?

WendyTje

1. Met restrictienegatieve E. colistammen bedoelt men, dat deze stammen je 'vreemd' binnenkomend DNA niet gaan verknippen. In de meeste Wild Type stammen (die restrictie positief zijn) zal dit binnenkomend materiaal als afweermechanisme verknipt worden.

aha, dat zijn dus alle bactierien die je voor dat soort doeleinden gebruikt.

Als je in je DNA-fragment, slechts 1 basepaar wil veranderen, kan je dit dan alleen doen door mutatie in je primer te steken en deze dan via PCR te transformeren naar een ds (gemuteerd in beide strengen) DNA?

Ja dat lijkt me wel de manier. Al introduceer je met PCR en niet de meest fancy polymerases vaak een stuk meer mutaties dan je lief is. Dit kun je voorkomen door speciale polymerases te gebruiken, of een klein stuk te PCRen en via knippen en plakken in je grote geheel stoppen, dus niet je hele plasmid op-PCR-en.

2. Als je dit inderdaad met restrictie enzymen doet, en het verschil in je bandjes nagaat, kan je dan met precisie bepalen waar het gen zich ergens bevindt?

Wel als je weet hoe je plasmide eruit ziet. Als je de sequentie hebt van je plasmid (zonder insert gen) kun je precies bekijken/ berekenen (zijn ook veel programmatjes voor) waarje enzym knipt en precies welke stukjes dit geeft. Krijg je met gen een ander/aanvullend patroon dan moet dit terug te puzzelen zijn, in de meeste gevallen

3. Dankje voor je quote (vanop het internet). 'k Wist niet dat 1 bp verschil in ssDNA zo'n veel grotere inpact had in vergelijking met je dsDNA. Snap de redenering dat het wel degelijk met de instabiliteit heeft te maken van zo'n single chain, en het vormen van secundaire structuren (loops) en dergelijke meer.

google is zo handig soms.

De bedoeling is wel degelijk dat we dit trachten op te lossen met allerhande technieken die het snelste en goedkoopste zijn. Natuurlijk is het altijd het beste als je gans je fragment van interesse gaat sequeneren, maar dit is meestal meer werk, duurder, en je bekomt hetzelfde resultaat.?

Daar heb je gelijk in. Al is je resultaat met sequencen wel een stuk directer en zekerder, maar op een "low budget" lab niet altijd even gewenst.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Gentech

Gentech

Re: Gentech

Re: Gentech

Re: Gentech