PCR RLFP (gel) aan bacterieel DNA linken

[MFaba]

Hallo allemaal,
 
Voor een schoolproject hebben wij een gelelectroforese gedaan van een PCR product van een bacteriekolonie. De kolonie is gegroeid in vloeibare cultuur, hier is het DNA van geïsoleerd en onderzocht dmv die PCR. 
Ook is er een API test gedaan met deze koloniesoort. 
Nu hebben we met de API een resultaat van boven de 95% en op de gel zijn duidelijke bandjes te zien nadat dit geknipt is met een restrictieenzym. Ook zijn de primers bekend. Kortom: primers bekend (inclusief fw re sequence), RE bekend met binding site, gel met bandjes en een API met 95%+ op een bacteriesoort. Hoe kan ik deze twee (API gevonden soort) en de bandjesgrootte aan elkaar linken, dus hoe kan ik dit aantonen? Ik heb al geprobeerd de DNA sequence van deze bacterie op internet te zoeken maar er zijn uiteraard velen strains en ik kan in bijna geen 1 sequence überhaupt mijn primer sequence terugvinden.. Hoe pak ik dit aan?
 
Groetjes, Jeroen

[Themisto]

Probeer altijd ten aller eerste af te vragen wat je onderzoeksvraag is. Waarom doe je dit experiment? Wat wil je weten? Hoe krijg je die informatie van dit experiment?

Heb je al geprobeerd om eerst een Primer-BLAST search te doen? Op die manier weet je voor welke sequentie je primers coderen (en dus voor welke geen en eventueel of die specifiek is voor een bepaalde bacterie stam).

Als je die sequentie hebt, kan je die dmv digitale tools knippen met de restrictie enzymen die jij hebt toegepast. Ga vervolgens na of de DNA fragmenten overeenkomen met de DNA fragmenten (bandjes) die jij op je gel ziet.

Helpt dit?

[MFaba]

Heb je al geprobeerd om eerst een Primer-BLAST search te doen? Op die manier weet je voor welke sequentie je primers coderen (en dus voor welke geen en eventueel of die specifiek is voor een bepaalde bacterie stam).

 
Bedankt voor de snelle reactie, heel fijn! 
 
Ik heb dit geprobeerd via ncbi, echter moet je hier vele gegevens invoeren waarvan ik niet altijd precies weet wat ze willen weten. Van beide primers (ITS Fw en Rv) heb ik een sequentie van 18 bp lang. 
Als ik beide sequenties invoer dan krijg ik foutmeldingen omdat ik dus nogmaals niet weet wat die andere waardes moeten zijn. Ook moet ik de verwachte fragmentregio (waar ik verwacht die primer te vinden) opgeven maar dit is dus wat ik uit wil zoeken, ik vul beide sequenties in bij Use my own forward primer (5'->3' on plus strand) en Use my own reverse primer (5'->3' on minus strand)

[Jaffaa]

om welke bacterie denk je dat het gaat? 
 
geef ook even de sequenties van de primers, kan ik er zelf ook even naar kijken en je eventueel op weg helpen.
 
greets

[Themisto]

Eigenlijk hoef je enkel zowel de Fw als Rev primer sequenties in te vullen (en eventueel de fragmentgrootte van het PCR product aanpassen zodat die past bij wat jij verwacht, vul een ruime waarde aan). Dan ga je naar 'Primer Pair Specificity Checking Parameters' en zorg je dat je bij 'organism' de naam van de bacterie invult. Lukt het hiermee?

Verder ben ik het eens met Jaffaa dat je het beste ook de primer sequenties hier kunt plaatsen. Dan kunnen wij met je mee denken en kijken waar het mis gaat bij de Primer BLAST.