[biologie] dna - fenol chloroform extractie

Beste WSF'ers,

Ik ben de laatste tijd bezig met het isoleren van DNA uit haren en speeksel (swabs) van paarden. De Chelex methode levert geen optimale zuiverheden, optimaal is tussen de 1,8-2,0 (ratio A260/A280), nu ben ik de fenolchloroform-extractiemethode aan het proberen. Nu heb ik verschillende artikelen gevonden met methodes voor het isoleren van DNA. Protocollen en artikelen zijn onderaan weergegeven.

Ik krijg geen constante waarden, en ik weet niet waaraan dit kan liggen. Ik zal de protocollen uitleggen van elke stap, misschien interpreteer ik wel iets verkeerd zodat de isolatie de verkeerde kant opgaat. Ik neem bij elk experiment een referentiemonster mee (negatieve controle). Ik meet de concentratie en zuiverheid met de Nanodrop.

Bij elk monster stop ik 3 haarwortels in een steriel 1,5 ml epje. Ik volg protocol die ik uit de artikelen heb (zie hieronder)
Soms zie ik een pellet en soms weer niet, de toevoeging van Glycogeen zit ik ook al aan te denken, zodat je kan zien waar je pellet zit. Ik houd wel rekening met de plek van de eventuele pellet door de epjes op een bekende wijze neer te zetten in de centrifuge, zodat ik weet waar de pellet zich gaat vormen. Mijn zuiverheden zijn soms goed, tussen de 1,8 -2,0 (haren), maar als ik het protocol voor (speeksel)swabs uitvoer, dan krijg ik ook zuiverheden van boven de 2, bijvoorbeeld 3,19. Daarnaast heb ik, omdat ik geen zuivere producten kreeg, een Microcon-filtratiestap ipv de ethanolprecipitatie uitgevoerd. Vergeleken met de referentiemonster, krijg ik bij de microcon-monsters error-waarden die niet verholpen kunnen worden. Bij beide protocollen krijg ik bij sommige samples wel optimale zuiverheden en concentraties, terwijl in datzelfde experiment (duplo)monsters ook andere waarden geven, zoals te hoge/lage zuiverheid of negatieve waarden bij de Nanodrop.

Graag wil ik jullie versie en ervaringen weten van fenol/chloroform. Doe ik iets fout in de procedure en waar kan het aan liggen dat ik geen constante waarden krijg? Ik heb natuurlijk bij elk monster 3 haarwortels erin gestopt, waarvan ik niet weet of deze allemaal dezelfde DNA opleveren, dus "echte" duploversies kan ik niet uitvoeren. Hetzelfde met de speekselswabs. Het feit dat ik soms wel goede resultaten krijg en soms niet (op dezelfde dag), betekend dat ik over het algemeen wat fout doe of misschien dat ene monster gewoon goed is geisoleerd en de andere niet.

Ik wil het DNA gebruiken voor STR bepaling, dus andere protocollen die werken zijn ook welkom. (al moeten de protocollen die beschreven staan in de artikelen toch gewoon werken?) Ik heb de beschikking over enkele kitjes van Qiagen/Invitek, maar ik vind deze nog wel veel tijd in beslag nemen en prijzig en de resultaten zijn ook niet altijd constant.

Graag wil ik jullie alvast bedanken voor de tips/opmerkingen die jullie plaatesn. Ik weet gewoon simpelweg niet wat ik "fout" doe.

Groetjes,

Snuffel

Protocol voor paardenhaar (artikel "Implications for the use of horse hair roots as a DNA
source for microsatellite typing" Czech J. Anim. Sci., 50, 2005 (11): 499–502)
Dag 1: Overnacht proteinase K digestie bij 56 °C.
- 3 haarwortels in 500 μl lysisbuffer (10 mM TrisHCL; 50 mM KCL; 0,5% Tween 20)
- extra toevoeging 20 μl Proteinase K (10 mg/ml)

Dag 2: Verwerking monster fenolchloroformextractie en EtOH precipitatie.
- Inactivatie ProtK 10 min. 95°C
#DNA extractie met fenolchloroform (commerciele kant en klaar oplossing van Sigma)
- eendezelfde hoeveelheid fenolchloroform (emulsievorming, goed schudden)
- Centrifugeer 10 min max rpm
- Waterige fase in steriel nieuw epje (waterige fase is de bovenste laag en daarin zit het DNA)
#Precipitatie met 96% Ethanol (EtOH)
- eerst 1/10 hoeveelheid 3M NaAc toevoegen
- 2,5 x volume EtOH (96%) toevoegen
- vortex - incubeer 30 min. nat ijs (0°C) (DNA precipiteerd) Ik heb gelezen dat op nat ijs ook een goed resultaat levert ipv de incubatie bij -20 graden
- Centrifugeer 30 min max. rpm
- Supernatant voorzichtig verwijderen (pellet soms niet zichtbaar, soms wel)
- was pellet met 70% EtOH -> Centrifugeer 15 min max rpm
- Verwijder supernatant voorzichtig
- Droog pellet aan de lucht (15 min)
- Los pellet op in 25 μl TE Buffer

Aangepaste versie van protocol voor swabs (artikel: "Collection of Genomic DNA from Adults in Epidemiological Studies by Buccal Cytobrush and Mouthwash", Vol. 10, 687–696, June 2001 Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention)
- Plaats Swab in 700 Lysis buffer (0,01 M TrisHCL, 0,01 M EDTA; 0,1 M NaCL; 2% SDS)
- vortex - incubeer 10 min bij kamertemperatuur
- 35 ProtK (10 mg/ml) toevoegen
- mix - incubeer 2 uur 58 C
- Swab wordt verwijderd en fenol chloroform extractie wordt uitgevoerd wat hierboven beschreven staat en ethanolprecipitatie, alleen ipv NaAC (3M) wordt er 1/10 2M NaCL toegevoegd, omdat er gewerkt wordt met SDS in de oplossing)

Ik ben geen expert op dit gebied, maar:

Soms zie ik een pellet en soms weer niet, de toevoeging van Glycogeen zit ik ook al aan te denken, zodat je kan zien waar je pellet zit.

Heb je alles goed gehomogeniseerd?

Ja, na het toevoegen van de TE buffer wordt het op de vortex gehouden, dus ik ga ervan uit dat het een homogene oplossing wordt..

Misschien iemand tips over het protocol, wordt het wel juist uitgevoerd? En heeft iemand andere ervaringen met de fenolchloroform-extractie?

Alvast bedankt!

Wat gebruik je als blanco voor je meting (nanodrop) en hoe ziet de grafiek van het sample eruit?
Op welke golflengte zit de piek die je ratio zo beinvloed (niet op 260 of 280 neem ik aan).

Wat voor een soort absorptie getallen haal je en wat is de concentratie DNA in je 25 ul ?
(ik vraag me af of je in de detectie range van de nanodrop zit met maar drie haarwortels)

Dit is een handleiding van de nanodrop met wat troubleshooting op pagina 97 & 98.
http://www.nanodrop....nual-8.5x11.pdf

Zit er variatie in hoe je de haarwortels verkrijgt?
Als je twijfelt aan het homogeniseren, zou je kunnen overwegen bijvoorbeeld een sonicator te gebruiken of gewoon langer incuberen op een (vertikaal) roterend wiel.


Ok, laten we de boel een niveau omhoog tillen. Als ik het goed begrijp is het doel om DNA te verkrijgen dat zuiver genoeg is voor een PCR, digestie en agarose gel elektroforese? Sequence je?
Een PCR kan over het algemeen vrij 'vies': hier in het lab waar ik werk worden 'viezere' biologische samples gebruikt voor een PCR en wij nemen de moeite niet om de boel op te schonen met een extractieprotocol en dat werkt allemaal prachtig (onder standaard omstandigheden).


-- verplaatst naar het Moleculaire Biologie forum --

Als blanco neem ik een negatieve controle mee. Het rare is, de grafieken zien er soms vloeiend uit naar behoren, kleine helling rond de A260. De grafiek van de hogere zuiverheden (boven de 3) is niet vloeiend, een rafelige piek bij A255 (absorptie 0,323) en de grafiek beging ook niet van linksboven te komen, er is gewoon een soort "piramide" als grafiek. Terwijl de A260 (absorptie 0,292) en de A280 dan een absorptie geeft van 0,095. En deze dus een zuiverheid geven van 3,06. En geeft een concentratie van 14,6 ng/ul. Soms krijg ik ook goede grafieken met een zuiverheid van 1,86 (0,588/0,317) en bijbehorende concentratie van 29,4. Ik weet niet of dit toeval is, of dit aan mijn uitvoering ligt of aan het protocol? Is het protocol wel juist dan of is het gewoon afhankelijk van je "beginmateriaal"? (=ik probeer erop te letten om elke keer dezelfde hoeveelheid te gebruiken)

Het verkrijgen van haarwortels en swabs, deze worden afgeknipt met een steriel gemaakte schaar en pincet. Het verschil kan natuurlijk ook liggen aan de haarwortels/swabs zelf en het DNA startmateriaal.

Vraagje; Wat is een roterend wiel? Is zo'n wiel gebruikelijk in een laboratorium?

Mijn doel is om een STR bepaling uit te voeren, dus met het gebruik van primers, PCR en een genetic Analyzer. Ik weet niet of met een zuiverheid van 1,40 en een concentratie van 233,3 ng/ul (deze zijn verkregen met de Chelex-methode uit 3 haarwortels), ik weet niet of deze "goed" genoeg zijn voor een PCR. Ik wil namelijk niet straks erachter komen dat bepaalde primers niet kunnen hechten omdat het DNA niet zuiver genoeg is en dan weer bezig moet met een ander protocol.

Hoe bedoel je met de laatste zin, dat je geen extracieprotocollen gebruikt om de boel op te schonen, hoe extraheer jij dan DNA uit een sample?

Zou je willen kijken naar mijn protocol? Is deze wel correct? Of is de fenolchloroform gewoon een kwestie van ervaring in de handelingen of geluk hebben dat je soms wel een optimale resultaten krijgt?

Heel erg bedankt voor je feedback!

Phenol/chloroform is een vrij simpele extractie methode. Zelf gebruikte ik phenol/chloroform alleen tijdens cloneringen en om in vitro RNA te verkrijgen.

Phenol/chloroform gebruiken voor een PCR is naar mijn mening een beetje te veel van het goede. Als ik jou was zou ik eerst het meest dirty protocol proberen. Mits je primers goed zijn ontworpen is een PCR meestal wel redelijk robust. Ik bedoel je kan zelfs een bacterie kolonie aanprikken en deze direct in je PCR reactie gooien. Veel viezer dan dat kan je bijna niet gaan.

Je sample in de proteinase gooien en het eiwit afdraaien is vaak al voldoende. Doe hier nog een isopropanol/ethanol extractie achteraan en je zou gewoon je PCR moeten kunnen draaien.

een roterend wiel is een wiel waar je epjes in kan vast zetten welke op een vrij rustig aan het roteren is en ja dat is vrij standaard spul . Nu kan je op een lab zitten waar ze dit niet hebben, dan zou je bijvoorbeeld een schudtafel kunnen gebruiken. Waar het om gaat is dat je sample maar in beweging blijft tijdens het homogeniseren. Als je op standje -niet extreem hard- homogeniseert dan kan je dit best een tijdje volhouden zonder je DNA te verkloten.

In een artikel worden verschillende extractiemethoden uitgevoerd, ook diegene die jij bedoeld, incubatie met Proteinase K en dan meteen EtOH precipitatie, maar ook fenol/chloroform na deze incubatie met Proteinase K en daarna pas EtOH precipitatie! Het verschil is dat het aantal volledige DNA profielen hoger is met de fenol/chloroform gevolgd door EtOH precipitatie dan meteen het laten te precipiteren met EtOH. (=conclusie uit het artikel; "Implications for the use of horse hair roots as a DNA source for microsatellite typing" Czech J. Anim. Sci., 50, 2005 (11): 499–502)

Zoals ik al zei wil ik wel volledige profielen kunnen maken, de kans dat er nog veel ge-troubleshoot moet worden met de ABI Prism 310 is groot en ik wil dan zeker weten dat het niet kan liggen aan het geisoleerde DNA.

Het is een redelijk gemakkelijk protocol, ik krijg dan nu ook te hoge zuiverheden (boven de 3,0), waar kan dit aan liggen? Is er misschien een stap die ik weg moet laten of juist moet uitvoeren om deze zuiverheid lager te krijgen? Ik kan natuurlijk ook meteen EtOH precipitatie uitvoeren na de lysis, kijken wat voor resultaten deze geeft.

Ik ga binnenkort wel een PCR runnen met een aantal primers, graag wil ik nog wel weten hoe ik een lagere zuiverheid kan krijgen (en niet 3,0) en of deze zuiverheid ook een probleem kan zijn in de PCR?

Alvast bedankt!

Een 'te hoge zuiverheid'? volgens mij bestaat dat niet eens.
deze 3,0, is dat je 26/280? De enige manier om te weten of het je PCR beinvloed is door het te proberen.

Bij de resultaten van fenolchloroform krijg ik inderdaad hoger dan 3,0 (de ratio 260/280), omdat tussen de 1,8-2,0 zuiver DNA is, wat is dan hoger dan 2,0?

Vandaag weer fenolchloroform uitgevoerd, na beide centrifugatiestappen zag ik bij 1 monster een pellet, deze pellet geresuspendeerd in 50 ul TE buffer, samen met de referentiemonster als blanco en dan krijg ik negatieve absorpties :s Dat klopt dus helemaal niet, dat betekend dat in mn referentiemonster die als blank is genomen meer DNA (meer absorptie) bevat dan het daadwerkelijke monster. Ik vind dit heel raar en baal er ontzettend van. De ene keer krijg ik positieve waarden en de andere keer negatieve.. Is het misschien dat ik iets fout doe bij de precipitatie?

Iemand anders die ervaringen heeft met fenolchloroform en een STR bepaling dmv PCR? Of zal ik toch een ander protocol proberen?

Ik heb ervaring met phenol chlorophorm extracties en voor zover ik weet is het vrij eenvoudig en recht toe recht aan, ik zou je dan ook niet kunnen vertellen wat er fout zou kunnen zijn gegaan. Een mogelijkheid is dat je extractie wel juist is gegaan echter doordat je nog een contaminatie van phenol hebt. Als je de phenol/chlorophorm extractie uitvoert, centrifugeer je je sample (met phenol/chlorophorm) dan? Tevens moet je nooit te hebberig zijn in het afzuigen van je waterige phase. Laat liever een beetje staan en los je sample op in minder TE dan dat je afwijkende waarden hebt. Dat is naar mijn idee het enige wat fout zou kunnen gaan. Dat je pellet verliest is jammer maar dat kan soms gebeuren (op welke temperatuur werk je? koude temperaturen willen soms nog wel eens helpen)

Weet je precies wat je meet op 260 nm en 280 nm en waarom je dit doet. Ik krijg het idee dat je niet precies weet waar je mee bezig bent. Zuiverder dan zuiver kan bijvoorbeeld niet. Ook is het heel onwaarschijnlijk dat er meer DNA in je blanco (ik neem aan dat je hiervoor vers MQ water gebruikt) zit dan in je sample.

Als je mn protocol leest, zie je dat ik 10 min. maximale speed centrifugeer na de fenol/chloroform toevoeging
Ik kan voortaan wel iets minder waterige fase nemen. En nog minder TE buffer dan 25 ul? Wanneer moet ik dan bij koudere temperaturen werken? Of bij elke stap de monsters op ijs houden?

Mijn blanco is mijn negatieve controle, (alle stappen van het protocol, maar dus geen startmateriaal), de nanodrop is vrij eenvoudig, je maakt eerst een blanco en dan meet ik mijn samples. De absorpties bij bepaalde golflengte (hier dus de A260 voor nucleinezuren) en de ratio A260/A280 bepaald de zuiverheid, deze ratio moet tussen de 1,8-2,0 liggen, dit geeft dan aan dat het geisoleerde DNA zuiver is. Als de teller (=A260 nucleinezuren) in verhouding hoger is en de noemer (=A280, eiwitten), dan komt hier een hoger getal uit, dus boven de 2,0. Ik heb dit nog niet vaker gehad, dat de waarde boven de 2,0 uitkomt, dus ik vroeg mij af wat voor conclusie ik hieruit kon trekken.

Als ik mijn referentiemonster (mijn negatieve controle) als blank gebruik en daarna een monster meet, dan zijn soms de absorpties negatief. Betekend dit dan niet dat mijn blancio meer absorbeert dan mijn daadwerkelijke monsters?

Hoe groot is de totale recovery (DNA) ongeveer? Het kan niet veel zijn..
De getallen die je eerder noemde: 260/280 van 1,40 bij 230 ng/ul moet voldoende zijn voor een PCR. Zoals Wouter al zei is het vrij gebruikelijk om een colony-PCR te draaien waarbij je een bacterie colonie aanprikt en dat direct in je PCR mix gebruikt.
Hier gebruiken we een doodsimpel lysis protocol op het weefsel en verder niets. Wat NaCl, SDS, zout.. ik kan het wel even navragen voor je als je wil. Dat kost zeer weinig tijd en gaat zo de PCR in (met mooie resultaten).

De 260/280 ratio heb je inderdaad goed door. De enige kanttekening is dat 'zuiver' gaat over contaminatie met eiwitten, verder kan je niets zeggen over zuiverheid. Fenol / chloroform resten zullen je ratio lager doen uitkomen, niet hoger. Het is dus onwaarschijnlijk dat je dat nog over hebt in je eindproduct.

Als je de nanodrop aan zet en het programma draait moet je het bakkie 'nullen', ik neem aan dat je dat met mQ water doet? Vervolgens een blanco meting (TE buffer) en daarna je samples, inclusief je negatieve controle. Probeer dat eens en als je negatieve controle gekke getallen geeft weet je dat het aan een (of meerdere) van de componenten van de extractie methode ligt.

Je zou ook nog een RNase kunnen toevoegen aan je TE overigens. Ook ben ik geen fan van TE buffer en er is niet echt een reden het te gebruiken voor jouw toepassing. Je kan het vervangen door nuclease vrij water (kost geen klap bij een promega, sigma, etc). TE bevat EDTA en dat kan weer rommelen met je PCR, etc. Het is misschien niet veel maar er is gewoon geen reden om TE te gebruiken in dit geval.

Als de zuiverheid tussen de 1,8-2,0 ligt, dan is de concentratie rond de 30 ng/ul.
Bij hoger dan 2,0 wordt deze aanzienlijk lager, rond de 10 ng/ul.
En bij de Chelexmethode krijg ik van haren een zuiverheid rond de 1,3 - 1,4 en dan een concentratie van tussen de 200 en 300 ng/ul.

Ik heb ook een ander lysis protocol met NaOH voor speeksel. Wil je even kijken of deze overeenkomt met jouw protocol?

1)
- Droog swabs, stuk swab in epje met 20 ul NaOH (0,2M)
- Incubeer 10 min. 75 graden

2) Voeg 180 ul Tris-HCL (0,04M; pH 7,5)
Oplossing is klaar voor de PCR

Wat ik mij dan afvraag, waar gaat de swab (het monster) heen, moet deze verwijderd worden na de incubatie van 75 graden?

Daarnaast heb ik een ander protocol gevonden die er op lijkt, maar dan voor haren.

1)
- 6 haar follikels in epje met 100 ul NaOH (0,2M)
- Incubeer 15 min. 95 graden
2) Voeg 100 ul Tris-HCL (0,1M;pH 8,5)
3) Vortex 30 sec. en centrifugeer 2 min 14000 rpm
4) Er wordt 1 ul gebruikt voor de PCR reactie

Betekend dan hier dat de haren eruit moeten na de incubatiestap (stap 1)? Of is hier de centrifugatiestap voor en dat het supernatant naar een schoon epje gebracht kan worden na stap 3?

Klopt, de eerste meting wordt met mQ water gedaan, daarna wordt er een blank gemaakt, omdat de negatieve controle ook weer in de TE buffer terecht komt heb ik de negatieve controle als blank, maar ik kan inderdaad nieuw gemaakte TE buffer als blank nemen en kijken wat het verschil is met mijn negatieve controle. (ik hoop inderdaad dat de negatieve controle dan geen rare waarden weergeeft, want dan ligt het toch ergens aan het protocol) En ik zal mijn pellets voortaan resuspenderen in nuclease-vrij water ipv TE buffer.

Als laatste zou ik graag jouw protocol willen zien, zou je deze op het forum willen zetten? Dankje

Ik ga vandaag die lysis-methode testen, ik laat jullie weten wat er uitkomt

Mijn blanco is mijn negatieve controle, (alle stappen van het protocol, maar dus geen startmateriaal), de nanodrop is vrij eenvoudig, je maakt eerst een blanco en dan meet ik mijn samples. De absorpties bij bepaalde golflengte (hier dus de A260 voor nucleinezuren) en de ratio A260/A280 bepaald de zuiverheid, deze ratio moet tussen de 1,8-2,0 liggen, dit geeft dan aan dat het geisoleerde DNA zuiver is. Als de teller (=A260 nucleinezuren) in verhouding hoger is en de noemer (=A280, eiwitten), dan komt hier een hoger getal uit, dus boven de 2,0. Ik heb dit nog niet vaker gehad, dat de waarde boven de 2,0 uitkomt, dus ik vroeg mij af wat voor conclusie ik hieruit kon trekken.

Als ik mijn referentiemonster (mijn negatieve controle) als blank gebruik en daarna een monster meet, dan zijn soms de absorpties negatief. Betekend dit dan niet dat mijn blancio meer absorbeert dan mijn daadwerkelijke monsters?

Wat het betekend kan ik zo absoluut niet zeggen, misschien zijn de absolute waarden dusdanig laag dat je onder de detectie limiet komt. Dat is een mogelijke verklaring van rare getallen.. (klinkt meer als een fout in je blanco maar goed. Let ook op dat je je niet blind moet staren op de 260/280 ratio. De absolute waarden zijn net zo van belang. Het belangrijkste is dat je er een PCR mee kan doen, je hoeft het niet te sequencen. Dat is iets wat je na verloop van tijd wel op zal pakken. Sommige dingen kan je -en moet je (uit het oogpunt van kosten en tijd)- vies doen, terwijl andere dingen juist erg schoon moeten.

Ik heb vandaag meerdere protocollen uitgevoerd:
1) Swab in 20 ul NaOH (0,2M), 10 min bij 75 graden, toevoeging van 180 ul TrisHCL
Zuiverheden A260/A280 rond de 1,5.
A260/A230 rond de 0,26.
Concentraties tussen de 50-90 ng/ul

2) Aangepaste protocol (eerste post uitgelegd) voor swabs
- Fenol chloroform extractie
Ik kreeg weer negatieve waarden, had mijn pellets nu in nuclease-vrij water geresuspendeerd. Ik heb eerst de negatieve controle als blanco genomen, hier kreeg ik negatieve waarden. Toen heb ik nuclease-vrij water als blanco genomen en toen de negatieve controle gemeten, hier bleek inderdaad DNA in te zitten. (daarom kreeg ik dus negatieve waarden als ik mijn negatieve controle als blank nam, er zit namelijk wel DNA in!!) Maar hoe dit kan is nog onbekend, ik heb zo steriel mogelijk gewerkt, alle stappen in de flowkast gedaan.

3) Ethanol precipitatie meteen na de lysis van het aangepaste protocol.
Ik krijg positieve waarden. Bij sommige monsters zijn pellets te zien. Zowel beide monsters (humaan en paarden speeksel) geven zuiverheden A260/A280 rond de 1,5, maar de A260/A230 zijn rond de 0,7-0,8. De concentraties ligt tussen de 30-40 ng/ul.

Of het nu aan de fenolchloroform methode ligt, dat mijn negatieve controle niet meer negatief blijkt te zijn maar toch DNA bevat, dat weet ik niet. Soms krijg ik ook positieve waarden bij de fenolchloroform.

Ik ben blij dat ik ook met een simpele extractiemethode DNA kan verkrijgen, maar mijn voorkeur gaat toch uit naar EtOH precipitatie meteen na de lysis. Ik ga binnenkort ook even checken of dit werkt bij haren.

Mrtn? Zou je toch nog je protocol willen posten? Thanks!

Bedankt voor jullie hulp