Springen naar inhoud

[biologie] dna - fenol chloroform extractie


  • Log in om te kunnen reageren

#16

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 14 oktober 2009 - 02:18

Dat je monster adsorptie geeft bij 260nm wil niet zeggen dat er DNA in zit, dat kan namelijk niet (of je reagentia moeten besmet zijn met DNA). Een van de stoffen die je gebruikt zou kunnen absorberen @ 260nm, hoewel een standaard verhaal als fenol/chloroform dat niet zou moeten doen. Misschien de Tween20?

De getallen die je geeft bij het eerste protocol (A260/A280 rond de 1,5 & concentraties tussen 50 en 90 ng/ul) zijn goed genoeg voor een PCR. Ik zou je willen aanraden nu je tijd te steken in het testen van de PCR met deze condities en je geen zorgen te maken over precipiteren van DNA etc.


Het protocol dat men hier gebruikt is voor iets ander materiaal (zie PB voor details) maar is zeer vergelijkbaar.
200 ul 50mM NaOH (vers)
10 min @ 95 graden (NIET langer)
vortex 30 sec
neutraliseer met 50 ul 1M Tris pH8, mix well
spin for 5 minutes (12-13 Krpm, normaal gezien gewoon max voor normale labcentrifuges), pellet moet zichtbaar zijn
gebruik 0.5 tot 1 ul voor een 25 ul PCR reactie (uiteraard het pellet niet gebruiken/aanraken met je pipet want het is cell debris en niet je DNA)


---edit: ik kan je geen PB sturen omdat je postvak vol is of omdat je PB hebt uitgeschakeld. PB me je mailadres aub, dan kan ik je de aanvullende informatie op die manier sturen.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#17

Snuffel

    Snuffel


  • >25 berichten
  • 78 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 14 oktober 2009 - 07:35

Hoi!

Mijn lysis buffer die ik toevoeg bij de swabs is (0,01 M TrisHCL, 0,01 M EDTA; 0,1 M NaCL; 2% SDS), ik zal eens opzoeken of bepaalde componenten absorberen. Want het is inderdaad onmogelijk dat er na fenolchloroform extractie en dan mijn negatieve controle in TE buffer wordt opgelost (in mijn negatieve controle zit geen DNA mag ik vanuit gaat), dat deze andere waarden geeft dan "schone" TE buffer als blank.

Zowel NaOH extractie als EtOH precipitatie meteen na de lysis geven beide wel goede waarden, alleen de A260/A230 is bij de EtOH wel hoger (meestal een 2e indicatie qua zuiverheid). Ik zal de EtOH nog een keer uitvoeren om te kijken of deze reproduceerbare gegevens geeft.

Inderdaad, ik had mijn PB uitgeschakeld!

Ik ga een paar primers bestellen en kijken of deze product geeft!

Bedankt dat jullie met mij meegedacht hebben over het onderwerp en bedankt voor de tips en info die jullie gaven! :eusa_whistle:

#18

Snuffel

    Snuffel


  • >25 berichten
  • 78 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 16 oktober 2009 - 13:46

Mijn lysisbuffer heeft ongeveer een concentratie van 10 ng/ul, dit is sowieso lager dan de resultaten die eruit komen na de isolatie.

Ik zat te bedenken dat ik ook ProtK toevoeg, maar die inactiveer ik niet na de incubatiestap. Nu heb ik dus een extra incubatiestap van 95 graden (10 min) erbij gedaan. De EtOH precipitatie zonder deze incubatiestap leverde constante en goede resultaten, nu heb ik dus het opnieuw uitgevoerd en de extra incubatiestap toegevoegd voor de inactivatie. Nu krijg ik hele hoge concentraties, niet dus erg reproduceerbare waarden en de waarden die ik verwacht. Iemand tips over het inactiveren van Proteinase K?

De NaOH waarden van de vorige keer waren van humane swabs (die van mezelf), nu heb ik paardenswabs met dezelfde stappen geisoleerd en krijg ik zuiverheden rond de 1,0 en concentraties tussen de 26-37 ng/ul. Dus velen malen lager dan met speeksel swabs, ik weet dus niet of dit ligt aan de afname van de swabs of aan het soort materiaal. Zucht, ik had gehoopt dat ik reproduceerbare resultaten eruit kreeg, zowel bij de EtOH precipitatie als de NaOH methode. De enige reproduceerbare methode is de Chelex tot nu toe (haren, zuiverheid rond de 1,4 en concentraties van 200-300 ng/ul). Ik ga sowieso een aantal van deze monsters testen met de PCR volgende week. Ook ga ik het protocol van NaOH op haren uitvoeren.

Bedankt voor jullie tips tot nu toe :eusa_whistle: En als jullie er nog wat hebben, dan hoor ik die graag ](*,)

#19

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 20 oktober 2009 - 01:32

Het is niet nodig je ProtK te inactiveren, die haal je er met de fenol/chloroform extractie wel uit: de eiwitten zitten niet in de DNA fractie dus die laat je achter in het epje. Je hoeft je geen zorgen te maken dat je Taq aan stukken gaat lijkt me (het enige bezwaar.. evt voor de zekerheid een hot-start onmiddellijk na het toevoegen van je Taq).

Een absorptie gelijk aan 10 ng/ul in de negatieve controle is niet iets om je zorgen om te maken als je 200-300 ng/ul vindt in je samples. Als je echter net een recovery van rond de 30 ng/ul zit, is het opeens een enorme afwijking.
Probeer wat meer uitgangsmateriaal te verkrijgen als je een swab gebruikt: echt lekker schrapen aan de binnenkant van de wang van het paard zodat je cellen mee krijgt.
Misschien een extra haarwortel gaan gebruiken?

Hang in there, dit gaat gewoon werken! :eusa_whistle:
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#20

Snuffel

    Snuffel


  • >25 berichten
  • 78 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 03 november 2009 - 20:55

De NaOH op haren geven goede resultaten met de Nanodrop! :eusa_whistle: Toch heb ik deze met de PCR getest en ik zie haast geen bandje (het bandje is zo vaag dat ik niet kan zeggen of het wel een bandje is :s)
Donderdag ga ik opnieuw haren isoleren met de Fenolchloroform (laatste keer ](*,)) en testen met de PCR, ik zal vrijdag jullie opnieuw posten met wat PCR/agarosegel materiaal, ik heb nogal wat vraagjes waar ik mee zit..

Groetjes

#21

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 november 2009 - 01:17

Er is geen garantie dat je met het andere protocol een beter bandje gaat vinden, soms heeft dat gewoon wat optimalisatie nodig. Wat meer cycli, extra Mg2+, een andere Ta.. dat soort dingen. Heb je een thermocycler met temperatuur gradiënt tot je beschikking?
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#22

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8454 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 november 2009 - 01:22

Zou je dan ook een scan van je gel in combinatie met je gebruikte PCR programma kunnen posten? Als de concentratie van de nanodrop goed is, dan zouje kunnen proberen te spelen met de Magnesium concentratie. Door een hogere Magnesium concentrate te gebruiken verhoog je de efficientie waarmee je primers aan je DNA binden, het nadeel hiervan is dan dat de specificiteit afneemt. Dat is dus een afweging die je moet maken. Je zou een gradient tot en met 3x de standaard hoeveelheid Magnesium kunnen gebruiken. Meer kan natuurlijk ook, maar ik zou eens beginnen met een gradient tot 3 keer.

Verder zou een variatie van je Tm in een gradient danwel een touchdown PCR kunnen helpen. Een touchdown PCR is met name hulpvol als je specificiteit te laag is (dus a-specifieke bandjes in je 'normale PCR'), waarmee je dus indirect een 'te hoge' Magnesium concentratie kan corrigeren.

Om zeker te weten dat er uberhaupt iets geamplificeerd wordt zou je een zilver staining of realtime PCR (lagere minimale detectiegrens dan EtBr en sybrsafe) kunnen gebruiken.
"Meep meep meep." Beaker

#23

Snuffel

    Snuffel


  • >25 berichten
  • 78 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 04 november 2009 - 17:35

Ik weet dat er inderdaad veel factoren afhangen van het ontstane product met de PCR.. Tot nu toe is er de annealingstemperatuur veranderd, ik zal vrijdag een uitgebreide post met plaatjes enzovoort posten van wat ik heb gedaan en gekregen, met daarbij een eerder gevonden (raar) bandje in een gel die ik eerder niet zag..

Ik gebruik de instellingen die in het artikel weergegeven staan waar ik mijn primer uit heb.

Ik houd jullie op de hoogte!

#24

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8454 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 november 2009 - 13:57

Altijd zelf alles nog een keer proberen te bepalen, nooit zomaar dingen klakkeloos aannemen, ook in een artikel kunnen fouten staan.

Je zou je PCR product kunnen proberen op te schonen en hier opnieuw een PCR op te doen.
"Meep meep meep." Beaker

#25

Snuffel

    Snuffel


  • >25 berichten
  • 78 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 12 december 2009 - 15:52

Hoi!

Heb al een tijdje niks van me laten horen, ik was het nog niet vergeten. Maar ik heb eindelijk met andere samenstelling van de PCR-mix een bandje kunnen zien. Ik heb ook de Chelex met de Fenolchloroform vergeleken en zie hierin geen verschil in intensititeit van het bandje. Wel kan ik zien dat de twee isolatiemethodes die een ander soort paard hebben geisoleerd en met het gebruik van 1 primerset, dat deze te zien is in het hoogtevesrchil van het bandje, dus dat is wel een goed teken! :eusa_whistle:
Nu ben ik bezig met het uiteindelijke STR analyse mbv ABI prism 310.

Zodra ik weer vragen heb dan zal ik deze stellen, ik wil jullie bedanken voor jullie hulp en feedback die jullie mij hebben gegeven! ](*,)

Groetjes Snuffel

#26

DonkerGefliptheid

    DonkerGefliptheid


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 02 december 2011 - 21:30

Ik heb zelf ervaring met een fenol/chloroform extractie voor het isoleren van DNA uit bloed, maar gebruik daarbij weer een ander protocol. Ik zie dat je soms wel of geen pellet ziet, maar dat is heel normaal. In haren(/haarzakjes) en swabs zit veel minder DNA dan in bloed, en ook bij bloed kunnen pellets heel erg klein zijn. Dus het is vrij normaal als je 'geen' pellet ziet. Want in het laboratorium is het normaal om te beseffen dat wat je niet ziet er wel degelijk kan zijn. Je moet alleen wel weten waar je pellet

Wat ik zelf doe is dat ik eerst de buffy coat van bloed pak. De cellen lyseer ik door toevoegen van 1% SDS en 10 minuten op 96 graden Celcius te incuberen. Vervolgens 2x een fenol/chloroform extractie (2 x omdat er vaak nog teveel eiwitten aanwezig zijn om met 1x een fenol/chloroform extractie verder te gaan) en een precipitatie met isopropanol. Het pellet los je dan vervolgens op in TE buffer met RNase.
Righteous judgement is passed on those who commit crimes against justice in full conscience.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures