Het juiste gen vinden en isoleren

die hanze

Hoe isoleren ze een gen uit een genoom? Ik weet dat er enzymen zijn om het dna in stukken te knippen maar hoe laat je die juist het gen dat je nodig hebt uit de duizenden anderen er uit te pikken ?

Wouter_Masselink

daar gebruik je geen restrictie enzymen voor. In principe zullen specifieke primers en een PCR reactie worden gebruikt om een gen te isoleren. Dit kan op genomisch maar net zo goed (en voor mijzelf gebruikelijker) op cDNA.

Mrtn

Hm, aan de vraag te zien heb je daar misschien iets meer uitleg bij nodig.

Restrictie enzymen knippen heel specifieke sequenties van het DNA. Ze hebben een sequentie die ze herkennen en dan knippen ze bijvoorbeeld na de A in TCGACG. Je kan daarmee een genoom aan flarden knippen maar dan weet je nog niet welk fragment je gen bevat.

Met een PCR kan je een primer kiezen (maken) die zó specifiek is voor een bepaald stukje dat hij alleen daar zal hechten. Die primer zal dus maar op één plek in het genoom hechten (als je het goed hebt gekozen) en vanuit daar kan je een PCR draaien om een kopie te maken van het gen. Dat kun je daarna wel weer wat opschonen door er stukjes af te knippen bijvoorbeeld.

Wiki over PCR en een goed plaatje.

spark

Aan de hand van een gen- en restrictiekaart van het fragment waar je het gen uit wilt halen kun je achterhalen welk restrictieenzym je het best kunt gebruiken. Na het knippen kun je inderdaad een PCR doen, alleen heb je hiervoor wel specifieke primers nodig.. als die er niet zijn kun je de fragmenten eventueel in een vector ligeren en dmv bacterien het fragment vermenigvuldigen (de laatste methode wou ik toch nog even toevoegen)

Wouter_Masselink

Direct een PCR doen zonder eerst een restrictie uit te voeren kan prima,dat is geen enkel probleem. Verder is het veel lastiger om zonder een PCR je gen in een vector te ligeren. Simpelweg doordat je hoeveelheid DNA lager is (tenzij je met een veel grotere hoeveelheid sample begint.)

Tevens zal je in je getransformeerde bacterie niet alleen het fragment amplificeren, het hele construct zal geamplificeerd worden.

Mr.Darwin

Ik snap nog steeds niet hoe men een deel gewenst (enkelstrengig) DNA kan amplificeren tot precies op het einde van je gewenst DNA (in het geval dat daar geen restrictiesite voorkomt). Het begin van je stukje is precies bepaald door die primer, maar hoe zit het met dat einde?

Mrtn

In de eerste cyclus loopt het polymerase zo lang als je het tijd geeft. Dat geeft vrijwel altijd een te lang product, maar wat gebeurt er met die te lange fragmenten in de tweede cyclus? Waar hechten de primers zich na stap 4 in figuur 2?

Zie hier

Overigens zullen die twee enkele strengen (ssDNA) weer een dubbele worden: een kort stukje dsDNA.

Als je er niet uit komt, teken het voor jezelf.. stap voor stap.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Het juiste gen vinden en isoleren

Het juiste gen vinden en isoleren

Re: Het juiste gen vinden en isoleren

Re: Het juiste gen vinden en isoleren

Re: Het juiste gen vinden en isoleren

Re: Het juiste gen vinden en isoleren

Re: Het juiste gen vinden en isoleren

Re: Het juiste gen vinden en isoleren