Wetenschapsforum

Halllo allemaal,

Ik heb in het labo een experiment uitgevoerd ivm metagenomics. Het doel is om via metagenomics DNA van organismen uit de Zenne te screenen om uiteindelijk te zien wat voor activiteit er allemaal is (bvb resistentie tegen bepaalde stoffen).

We zijn eerst ook begonnen met een ressistentie ratio te bepalen, daar heb ik geen problemen mee.

Met het volgende deel daarentegen heb ik moeite om het volledig te begrijpen.

We hebben dus Fosmiden toegevoegd aan ons water om verschillende inserts te bekomen zodat we uiteindelijk verschillende stukken DNA bekomen. dat fosmide steken we dan in een vector en de vector insereren we dan in E.coli. (Over de volgorde van deze dingen ben ik niet zeker, wat eigenlijk een groot deel is van mijn probleem) Hier zijn veel dingen onduidelijk voor mij:

ten eerste snap ik niet hoe we precies het DNA en het fosmide gekoppeld krijgen, insereert het fosmide in het volledige DNA en wordt het dan op de een of andere manier gesplitst samen met een DNA-fragment, of is ons DNA eerst in stukken geknipt met restrictie enzymen?

In het protocol staat dat we overnacht gegroeide cultuur samen hebben gemengd met Lb + 12,5Cm en induction solution, wat doet die induction solution juist?

Daarna brachten we ons fosmide in een vector, hoe gebeurd dit juist? Ik vind ook nergens in het protocol terug wanneer we er een vector bij hebben gedaan. Was ons fosmide al op voorhand in de vector?

Daarna hebben dit mengsel laten incuberen gedurende 5u waarna we het QIAGEN large contruction kit gebruikt hebben voor fosmide extractie, vanaf hier snap ik het weer

Sorry voor de slechte uitleg van de proef, maar ons protocol is ook niet echt geweldig, en aangezien ik deze proef 2 weken geleden gedaan heb en ondertussen nog andere proeven deed is het wat verwarrend geworden en geraak ik er niet meer aan uit.

PS: hieronder het deel van het protocol waar ik moete mee heb, maar veel zul je er niet aan hebben vrees ik

PROTOCOL:

Day 2: Identification of the resistance ratio

After an overnight incubation at 37°C, clones with resistance to one of the antibiotics or

metals will be counted and the resistance ratio will be calculated.

In the mean time, some clones will be selected and grown overnight at 37°C in liquid

medium (Lb + 12,5 Cm + antibiotic or metal).

Day 3: Extraction of fosmids

The overnight culture of the selected clones will be used for induction of the fosmid from

low copy-number to high-copy number using:

500 μl of overnight culture

4.5 ml of Lb + 12,5 Cm

5 μl of induction solution

The mixture has to be made in a 50 ml falcon tube and shaked at 225 rpm during 5 hours at

37°C. A 50 ml tube is required because aeration is critical.

After 5 hours of incubation, the cells will be centrifuged at 7000 rpm for 15’ at 4°C. These

can be stored at -20°C or immediately extracted. The extraction will be done using the

QIAGEN® large-construct kit.

Protocol QIAGEN large-construct kit: (hieronder volgt het protocol maar daar heb ik geen problemen mee

Weet je wat een fosmide is?