Ik ben bezig met een eiwitbepaling, dit ga ik doen aan de hand van de ELISA methode. Ik ben er globaal al achter hoe deze werkt, ik vraag me alleen af:
Is het ook mogelijk om hoeveelheden eiwit te bepalen en heb je daar dan een stopreagens of iets dergelijks voor nodig, anders blijft het enzym maar doorgaan neem ik aan.
Verder kan ik niet ontdekken hoe ik de substantie moet wassen elke keer na het toevoegen van een reagens. Doe ik dat gewoon door te centrifugeren?
Laatste berichten
-
14:19
Herleiden afmetingen vanaf een foto 2
-
12:33
Rotatie van het heelal 26
-
00:49
Ervaringen met "herontdekkingen" 11
-
21:28
hall effect in vloeistof gebruiken als stromingssensor 6
-
17:59
Gezocht: de/een naam voor een getallenrij met een cauchyrij als partieelsommenrij
-
17:28
Casus uit de praktijk: positief test THC 18
-
17 apr
speciale rel. theorie 4
-
17 apr
Vreemde stank in huis 11
-
17 apr
3 vragen over mijn rooskleurige r.berekening H2netGekoppeldeHBrflowbatterij.
-
17 apr
Interpretatie reactie-energie 3
-
17 apr
Logistic equation (Pierre Verhulst,Belgian Mathematician) 5
-
16 apr
vB 9
-
15 apr
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 1
-
15 apr
Python: sockets sluiten 4
-
14 apr
Een eenvoudige logische redenering waarom tijd niet kan bestaan 'daarbuiten' 6
-
14 apr
Hoe kun je op quantumwijze getallen vinden in een rij die kleiner zijn dan getal k 3
-
13 apr
Documentenverdwijnen uit onedrive 1
-
12 apr
Behoud van impulsmoment en energie 5
-
12 apr
INLOG STORING / TIPS 4
-
09 apr
[natuurkunde] systeemgrafen 1
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
ELISA
Moderator: ArcherBarry
-
- Berichten: 2.035
Re: ELISA
Thessa,
De meeste commerciele ELISA's zijn kwantitatief, dus hoeveelheden bepalen is dan juist de bedoeling van de assay... je moet dan wel een goede (gevoelige!) reader hebben
W.b. wassen: dat is helemaal afhankelijk van het ontwerp van de ELISA, en van de in de assay gebruikte substraten/labels.... om dit te kunnen beantwoorden zal je antwoord moeten geven op Gerard's vragen....
De meeste commerciele ELISA's zijn kwantitatief, dus hoeveelheden bepalen is dan juist de bedoeling van de assay... je moet dan wel een goede (gevoelige!) reader hebben
W.b. wassen: dat is helemaal afhankelijk van het ontwerp van de ELISA, en van de in de assay gebruikte substraten/labels.... om dit te kunnen beantwoorden zal je antwoord moeten geven op Gerard's vragen....
-
- Berichten: 3
Re: ELISA
Ok dit is wat ik tot nu toe weet van ELISA
Als aan een oplossing van eiwitten een specifiek antilichaam wordt toegevoegd, zal deze gaan reageren met de eiwitten in de oplossing. Hierna wordt de oplossing gewassen om de antilichamen die niet hebben gereageerd te scheiden van het product.
Na deze wassing wordt een anti-antilichaam toegevoegd met hieraan gekoppeld een enzym. Dit anti-antilichaam regeert met het antilichaam wat al gebonden zit aan het eiwit. Het product wordt weer gewassen.
Het enzym heeft de mogelijkheid een bepaalde stof om te zetten in een kleustof. Als deze stof wordt toegvoegd zal het enzym de stof dus omzetten. De kleur die dan ontstaat is dus te meten met een spectrofotometer en aan de hand van een calibratiereeks kan de concentratie bepaald worden.
Alleen wat ik dan dus niet snap is hoe de kleurintensiteit kan verschillen in de verschillende concentraties, want het enzym blijft toch in principe de reagens omzetten totdat deze op is. Of moet je hier met een stopwatch werken en een stopreagens zodat je de enzymactiviteit kunt bepalen.
Als aan een oplossing van eiwitten een specifiek antilichaam wordt toegevoegd, zal deze gaan reageren met de eiwitten in de oplossing. Hierna wordt de oplossing gewassen om de antilichamen die niet hebben gereageerd te scheiden van het product.
Na deze wassing wordt een anti-antilichaam toegevoegd met hieraan gekoppeld een enzym. Dit anti-antilichaam regeert met het antilichaam wat al gebonden zit aan het eiwit. Het product wordt weer gewassen.
Het enzym heeft de mogelijkheid een bepaalde stof om te zetten in een kleustof. Als deze stof wordt toegvoegd zal het enzym de stof dus omzetten. De kleur die dan ontstaat is dus te meten met een spectrofotometer en aan de hand van een calibratiereeks kan de concentratie bepaald worden.
Alleen wat ik dan dus niet snap is hoe de kleurintensiteit kan verschillen in de verschillende concentraties, want het enzym blijft toch in principe de reagens omzetten totdat deze op is. Of moet je hier met een stopwatch werken en een stopreagens zodat je de enzymactiviteit kunt bepalen.
Re: ELISA
Ok Thessa,
Het idee dat je hebt van een ELISA is zo ongeveer wel goed en n de praktijk ziet het er bijvoorbeeld zo uit
Je neemt een drager bijv een 96 wells microtiterplaat of sepharosebolletjes die je coat met een antistof specifiek gericht tegen het eiwit dat je wilt bepalen bijv albumine
vervolgens voeg je het monster toe waarin je albumine wilt bepalen.
na een incubatieperiodewaarin de albumine in je monster gebonden wordt, was je de welletjes met een buffer of de sepharose na afdraaien waardoor al het overige materiaal wordt verwijderd.
Nu voeg je opnieuw aan antistof tegen albumine toe maar dan gekoppeld met een enzymbv fosfatase en incubeer weer eentijdje.
Je wast opnieuw en vervolgens voeg je een substraat toe bv PNPP waardoor zich de kleur onstaat.
Als de kleur voldoende is kun je de reactie stoppen bv met zuur en de extincties aflezen. Deze stap is dus zoals je veronderstelde tijdkritisch en afhankelijk van de periode die nodig is om de kleur te ontwikkelen dit kan lopen van enkel minuten tot uren
Als je weet welk eiwit wilt bepalen kun op het ineternet zoeken of er een firma is die een kit levert om dit eiwit te bepalen en daar het voorschrift downloaden voor specifiekere informatie, mocht dit niet lukken geef dan nog een reactie dan zal ik eens kijken of de informatie kan vinden.
Gerard
Het idee dat je hebt van een ELISA is zo ongeveer wel goed en n de praktijk ziet het er bijvoorbeeld zo uit
Je neemt een drager bijv een 96 wells microtiterplaat of sepharosebolletjes die je coat met een antistof specifiek gericht tegen het eiwit dat je wilt bepalen bijv albumine
vervolgens voeg je het monster toe waarin je albumine wilt bepalen.
na een incubatieperiodewaarin de albumine in je monster gebonden wordt, was je de welletjes met een buffer of de sepharose na afdraaien waardoor al het overige materiaal wordt verwijderd.
Nu voeg je opnieuw aan antistof tegen albumine toe maar dan gekoppeld met een enzymbv fosfatase en incubeer weer eentijdje.
Je wast opnieuw en vervolgens voeg je een substraat toe bv PNPP waardoor zich de kleur onstaat.
Als de kleur voldoende is kun je de reactie stoppen bv met zuur en de extincties aflezen. Deze stap is dus zoals je veronderstelde tijdkritisch en afhankelijk van de periode die nodig is om de kleur te ontwikkelen dit kan lopen van enkel minuten tot uren
Als je weet welk eiwit wilt bepalen kun op het ineternet zoeken of er een firma is die een kit levert om dit eiwit te bepalen en daar het voorschrift downloaden voor specifiekere informatie, mocht dit niet lukken geef dan nog een reactie dan zal ik eens kijken of de informatie kan vinden.
Gerard
-
- Berichten: 131
Re: ELISA
Gerard schreef:
vervolgens voeg je het monster toe waarin je albumine wilt bepalen.
na een incubatieperiodewaarin de albumine in je monster gebonden wordt, was je de welletjes met een buffer of de sepharose na afdraaien waardoor al het overige materiaal wordt verwijderd.
Nu voeg je opnieuw aan antistof tegen albumine toe maar dan gekoppeld met een enzymbv fosfatase en incubeer weer eentijdje.
Bij de ELISA kit voor caseïne bijvoorbeeld, voeg je je monster dat caseïne bevat, toe en direct nadien ook caseïne antistoffen. Er zijn namelijk verschillende soorten ELISA's. Zo is de gluten assay kit bijvoorbeeld een sandwhich-methode, terwijl de caseïne kit een competitieve methode is. Caseïne in het monster en de toegevoegde caseïne gaan in competitie. Rusttijd en vervolgens wassen( met wasbuffer). Nadien peroxidase enzym toevoegen, wat enkel met de toegevoegde caseïne reageert. Dan rusttijd en weer wassen. Dan nog substraat ( of chromogeen ) dat reageert met het peroxidase en een laatste keer rusttijd. Om deze reactie te stoppen ordt er dan stop-reagens toegevoegd. Dus bij een kwantitatieve bepaling ( met ijklijn ) zal je hoogste standaard het minst gekleurd zijn. Kleur is dus omgekeerd evenredig met de concentratie.
