Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Moderator: ArcherBarry

Reageer

Bericht 11-05-'06, 13:40

vnm

Berichten: 1

Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Ik heb een project gekregen van school. Als experimenten moeten we de invloed van 3 verschillende alcoholen op de permeatiesnelheid van erytrocyten gaan meten.

Tijdens het experiment zal er hemolyse plaatsvinden en hemoglobine vrijkomen uit de erytrocyten. Het is de bedoeling dat we het hemoglobine fotometrisch gaan bepalen.

Ik heb alleen geen idee welke alcoholen geschikt zijn, hoe we de proef aan moeten pakken en bij hoeveel nanometer er gemeten moet worden.

Als tip staat bij het project dat we PBS (Phosphate Buffered Saline) moeten gebruiken... Maar daar kon ik ook niet verder mee... ;)

Enig idee hoe ik de proef kan aanpakken? Wie kan mij helpen...?

MVG

Roel :P
Omhoog

Bericht 11-05-'06, 20:43

Gerard

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Permeatie van alcoholen in de ery veroorzaken lysis van de ery en de hoeveelheid hb die vrijkomt per tijdseenheid is een maat voor de permeatie.

Ik zal een opzetje proberen te geven voor zover mijn kennis reikt.

Verdun volbloed met PBS (1:10) mengen en voorzichtig afdraaien.

Bovenstaande vloeistof afzuigen en nog twee maal herhalen.

Resuspendeer de ery's in PBS.

Neem een klein beetje ery's en lyseer deze. (door bv ultrasoon of invriezen en ontdooien) Afdraaien om de celwanden teverwijderen.

Maak hievan een verdunningsreeks 10x ; 100x enz. en meet deze bij 415 nm om te bepalen welke verdunning nodig is om binnen het meetbereik van de spectrofotometer te blijven.

Verdun de geresuspendeerde ery's met de verdunning die in de vorige stap is bepaald.

Doe in buizen een constant volume van de eryverdunning.

voeg een hoeveelheid alcohol toe en wacht 10? minuten, zachtjes afdraaien en in het bovenstaande de extinctie bij 415 nm meten.

deze extinctie gedeeld door de extinctie van de volledig gelyseerde ery's x 100 geeft het percentage gelyseerde ery's

Ik hoop dat je hier mee verder komt.

Gerard
Omhoog

Bericht 17-05-'06, 13:32

Coco_CF

Berichten: 3

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

JA oke maar watvoor soorten alcohol moeten we gebruiken dan??
Omhoog

Bericht 17-05-'06, 20:32

Gerard

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Ik denk dat je die zelf mag kiezen maar denk eens aan de volgende

1 ethanol de normale alcohol uit bier

2 glycerol een drievoudige alcohol wordt ook in voeding gebruikt.

3 octanol een hogere alcohol

.

Ik zou kijken welke alcoholen beschikbaar zijn en dan er drie kiezen met de meest van elkaar afwijkende structuur
Omhoog

Bericht 18-05-'06, 11:24

Coco_CF

Berichten: 3

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Ja oke bedankt! wij gebruiken die 3 en ook nog bier, wijn en bacardi...

Maar hoe kan ik de mate van polariteit van die alcoholen zien?
Omhoog

Bericht 18-05-'06, 16:28

Gerard

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

wij gebruiken die 3 en ook nog bier, wijn en bacardi...


Als je bier, wijn en bacardi gebruikt kun je geen conclusies trekken over de permeatie van alcohol omdat dit complex samengestelde stoffen zijn en je niet kunt bepalen wat er precies gebeurt.

Eventjes nog iets, als je de proeven uitvoert goed kijken wat er gebeurt en opschrijven want ik denk dat er mischien dingen gaan gebeuren die jullie niet verwachten.

Als je de proeven hebt uitgevoerd ben ik wel benieuwd naar de resultaten.

Gerard
Omhoog

Bericht 01-06-'06, 19:08

Gerard

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

PBS = Phosphate Buffered Saline= Fosfaat gebufferd zout

Los in 800 ml gedestilleerd water het volgende op:

8g NaCl

0.2g KCl

1.44g Na2HPO4

0.24g KH2PO4

Stel de pH in op 7.4.

Vul aan tot 1 litermet gedestilleerd water
Omhoog

Bericht 22-06-'06, 21:55

Coco_CF

Berichten: 3

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Waar kan ik ergens de mate van polariteit vinden methanol ethanol en 1 propanol??
Omhoog

Bericht 23-06-'06, 00:21

The Herminator

Berichten: 2.035

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

De zogenaamde "LogP-waarde" is een redelijke maat voor de polaritieit van een verbinding:

methanol: -0.77

ethanol: -0.31

1-propanol: 0.05

Hoe groter de apolaire portie van een molecuul, hoe minder polair hij zal zijn! Het is in dit geval (steeds een OH-groep en een toenemend aantal methyl(een)-groepen) natuurlijk ook makkelijk te beredeneren....

Waar denk je dat de polariteiten van octanol en glycerol uitkomen t.o.v. deze drie? 8-)
Omhoog

Bericht 01-07-'06, 18:04

sdekivit

Berichten: 704

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

The Herminator schreef: De zogenaamde "LogP-waarde" is een redelijke maat voor de polaritieit van een verbinding:
de P-waarde is de partitiecoefficient en is gedifinieerd als de verhouding van een hoeveelheid moleculen die zich na verdeling over een apolaire en een polaire fase zich bevindt in de apolaire fase in staat tot de hoeveelheid in de polaire fase.

--> meestal wordt hiervan de log van genomen.

Is voornamelijk ook van belang bij de farmacokinetiek 8-)
Omhoog

Bericht 02-07-'06, 10:17

The Herminator

Berichten: 2.035

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

LogP is eigenlijk een maat voor de verdelingscoefficient van een molecuul op een water/octanol grensvlak...... heel "vrij" vertaald kan je dit inderdaad "lipofiliciteit" noemen  :oops:

Die werken prima! In principe is er voor elk organisch molecuul een LogP-waarde (dat is de eenheid waarin de partitie-coefficient wordt uitgedrukt) te berekenen/meten! (ik kan het weten, ik heb er al zo'n 50 miljoen berekend, en doe dat nog elke dag  8-[ )


Ik werk in de geneesmiddelontwikkeling, dus ik weet iets van de LogP af ;)
Omhoog

Bericht 02-07-'06, 11:01

Gerard

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

QUOTE (The Herminator @ za 06 mei 2006 om 22:10 uur) (The Herminator @ za 06 mei 2006 om 22:10 uur)

Die werken prima! In principe is er voor elk organisch molecuul een LogP-waarde (dat is de eenheid waarin de partitie-coefficient wordt uitgedrukt) te berekenen/meten! (ik kan het weten, ik heb er al zo'n 50 miljoen berekend, en doe dat nog elke dag  )QUOTE


10 jaar elke seconde eentje berekend op je werk,bekijk je ze ook nog?

ik ben blij dat ik een andere baan heb :oops:
Omhoog

Bericht 02-07-'06, 11:09

The Herminator

Berichten: 2.035

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Ik bekijk ze inderdaad niet... dat laat je de software doen :oops:

Een typische berekening voer je uit aan 10.000-100.000 moleculen tegelijk, waarna je alle moleculen met een cLogP-waarde boven een bepaalde afkapwaarde verwijderd uit de set waarmee je verder werkt.

Hetzelfde geldt voor molecuulgewicht, aantal groepen met H-brug accepterende en H-brug donerende eigenschappen, wateroplosbaarheid etc. Zo hou je aan het eind een klein "setje" moleculen over die de juiste farmaco-chemische eigenschappen bezitten... en daarna begint pas het "echte" werk (eiwitmodelering) 8-[
Omhoog

Bericht 21-12-'06, 11:32

G1 Guppy

Berichten: 2

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Hoi Gerard,

ik heb een vraag:

Welk reagens zou je gebruiken om het vrijgekomen hemoglobine mee te meten? Gewoon van Kampen-Zijlstra of toch een andere?
Omhoog

Bericht 21-12-'06, 11:48

Gerard

Re: Fotometrisch meten van hemolyse (hemoglobine)

Zoals je in mijn antwoord van 11 mei ziet wordt het hemolysaat direct gemeten bij 415 nm zonder toevoeging van verder reagens.

Even een opmerking: Controleer wel de spectra van de samples met alcohol op interferentie van de drank bij 415 nm
Omhoog
Reageer

Terug naar “Moleculaire biologie en biochemie”