Laatste berichten
-
00:38
Logistic equation (Pierre Verhulst,Belgian Mathematician) 5
-
00:07
Casus uit de praktijk: positief test THC 11
-
19:47
vB 9
-
15:02
Interpretatie reactie-energie 2
-
15 apr
Vreemde stank in huis 9
-
15 apr
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 1
-
15 apr
Python: sockets sluiten 4
-
14 apr
Een eenvoudige logische redenering waarom tijd niet kan bestaan 'daarbuiten' 6
-
14 apr
Hoe kun je op quantumwijze getallen vinden in een rij die kleiner zijn dan getal k 3
-
13 apr
Rotatie van het heelal 22
-
13 apr
Documentenverdwijnen uit onedrive 1
-
12 apr
Behoud van impulsmoment en energie 5
-
12 apr
INLOG STORING / TIPS 4
-
09 apr
[natuurkunde] systeemgrafen 1
-
05 apr
afbuiging licht rond zware objecten via grondbeginselen relativiteitstheorie 490
-
05 apr
Ongepaste reclame 179
-
04 apr
Gegevens wissen mobiel 6
-
04 apr
Geiger Muller telbuis 2
-
03 apr
Schroefdraad berekening 3
-
03 apr
Relatieve luchtvochtigheid 26
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
transformatie van Ncor - CFP
Moderator: ArcherBarry
-
- Berichten: 8
transformatie van Ncor - CFP
ik heb als eerst digeste, ligatie uitgevoerd van Ncor met restrictie enzymen EcoRi + Sal1 + Sca1 en hetzelfde gedaan met CFP-C1 met EcoRi + Sal1. mijn vraag nu is de digestie van zowel NcoR als CFP-C1 zijn gelukt want op gel zien de bandjes er goed uit maar als ik hievan ligatie uitvoer en vervolgens aan een bactieriecultuur (E-coli) wil voegen zodat er transformatie plaats vindt. groeit er de volgende dag niks op de kanamycine resistente platen kunnen jullie me misschien helpen plzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz
-
- Berichten: 740
Re: transformatie van Ncor - CFP
Probeer iets duidelijker je vraag neer te zetten.
Hoe voer je je transformatie precies uit?
Zoals ik het begrijp is je ligatie product (vector + insert) goed, maar lukt je transformatie niet.
Hoe voer je je transformatie precies uit?
Zoals ik het begrijp is je ligatie product (vector + insert) goed, maar lukt je transformatie niet.
-
- Berichten: 102
Re: transformatie van Ncor - CFP
Het kan zijn dat NcoR en CFP-C1, niet resistent zijn voor Kana, of je transformatie is gewoon mislukt.
Ik weet het eerlijk gezegd ook niet,
Suc6 in ieder geval
Ik weet het eerlijk gezegd ook niet,
Suc6 in ieder geval
-
- Berichten: 740
Re: transformatie van Ncor - CFP
Aan resistentie ligt het niet.
De CFP heeft een Kan. selectie gen.
zie:
http://orders.clontech.com/clontech/techin.../pECFP-C1.shtml
De CFP heeft een Kan. selectie gen.
zie:
http://orders.clontech.com/clontech/techin.../pECFP-C1.shtml
-
- Berichten: 8
Re: transformatie van Ncor - CFP
DIGESTIE V NcoR:
VOLUME (MICROLITER)
pGEM-NcoR 10
EcoRi + Sal1+Sca1 0,5 + 0,5 + 0,5
Buffer H 2,0
Milli Q water 6,5
Digestie v CFP
VOLUME (MICROLITER)
pECFP-C1 1,0
EcoRi + Sal1 0,5 + 0,5
Buffer H 2,0
Milli Q water 16
Ligatie v CFP-NcoR
VOLUME (MICROLITER)
pGEM-NcoR(instert) 10
pECFP-C1(vector) 0,5
Rapid Ligation buffer (5*) 4,0
Milli Q water 4,5
T4 DNA ligase 1,0
En dan heb ik transformatie uitgevoerd met 100microliter van E-coli en 4 microliter van de ligatiemengsel
kun iemand my vertellen wat ik fout doe of kloppen myn restrictieenzymen niet
VOLUME (MICROLITER)
pGEM-NcoR 10
EcoRi + Sal1+Sca1 0,5 + 0,5 + 0,5
Buffer H 2,0
Milli Q water 6,5
Digestie v CFP
VOLUME (MICROLITER)
pECFP-C1 1,0
EcoRi + Sal1 0,5 + 0,5
Buffer H 2,0
Milli Q water 16
Ligatie v CFP-NcoR
VOLUME (MICROLITER)
pGEM-NcoR(instert) 10
pECFP-C1(vector) 0,5
Rapid Ligation buffer (5*) 4,0
Milli Q water 4,5
T4 DNA ligase 1,0
En dan heb ik transformatie uitgevoerd met 100microliter van E-coli en 4 microliter van de ligatiemengsel
kun iemand my vertellen wat ik fout doe of kloppen myn restrictieenzymen niet
-
- Berichten: 740
Re: transformatie van Ncor - CFP
Natuurlijk kan ik zo niet zien of je enzymen wel of niet kloppen. Daarvoor moet je wel de MCS laten zien.
De MCS van de vector heb ik wel, je kan ligeren met de EcoRI en SalI dus daar moet het niet aan liggen.
Wat ik wel zie is dat je na het knippen van de vector geen SAP reactie doet (deforforyleren van je vector) en daarop volgend een EtOH prec. doet om je RE's te verwijderen.
Verder is het belangrijk een goed protocol te gebruiken bij je transformatie, als deze niet goed is, mislukt het vrij snel.
De MCS van de vector heb ik wel, je kan ligeren met de EcoRI en SalI dus daar moet het niet aan liggen.
Wat ik wel zie is dat je na het knippen van de vector geen SAP reactie doet (deforforyleren van je vector) en daarop volgend een EtOH prec. doet om je RE's te verwijderen.
Verder is het belangrijk een goed protocol te gebruiken bij je transformatie, als deze niet goed is, mislukt het vrij snel.
-
- Berichten: 8
Re: transformatie van Ncor - CFP
he bedankt voor jullie snelle reactie dat stel ik zeer op prijs verder antw op je vraag Roy ja ik heb wel sap bij gedaan dat ben ik vergeten erbij te vermelden sorry about tht. Ik heb nog een vraag als mijn insert heel groot is kan het ook hierdoor komen dat mijn transformatie niet lukt en zo ja hoe kan ik dit probleem oplossen.
thxx 4 jullie moeite alvast
<table border='0' align='left' cellpadding='3' cellspacing='0'><tr><td padding='0' celspacing='0' align='left'><font size='1'># Moderatoropmerking</font></td></tr><tr><td id='moderator'><font size='1'>Beryllium: kan je iets meer op je spelling letten? Iets minder MSN-taal en meer komma's en punten maken je posts leesbaarder.</font></td></tr></table>
<div class='postcolor'>
thxx 4 jullie moeite alvast
<table border='0' align='left' cellpadding='3' cellspacing='0'><tr><td padding='0' celspacing='0' align='left'><font size='1'># Moderatoropmerking</font></td></tr><tr><td id='moderator'><font size='1'>Beryllium: kan je iets meer op je spelling letten? Iets minder MSN-taal en meer komma's en punten maken je posts leesbaarder.</font></td></tr></table>
<div class='postcolor'>
-
- Berichten: 740
Re: transformatie van Ncor - CFP
Hoe groot?
In de ECFP vector kunnen erg grote inserts.
Ik gebruikte bij mn EGFP een insert van 7 kb ofzo...
Als het te groot is moet je gebruik maken van alternatieve vectors zoals YAC's en BAC's. Je zou dan je ECFP gen kunnen knippen uit je vector en achter je insert kunnen plakken.
Ik denk zelf niet dat het hier aan ligt, inactiveer je je SAP alleen door bij 40 graden te zetten? Dit is vaak niet voldoende om ook je RE's te inactiveren...
In de ECFP vector kunnen erg grote inserts.
Ik gebruikte bij mn EGFP een insert van 7 kb ofzo...
Als het te groot is moet je gebruik maken van alternatieve vectors zoals YAC's en BAC's. Je zou dan je ECFP gen kunnen knippen uit je vector en achter je insert kunnen plakken.
Ik denk zelf niet dat het hier aan ligt, inactiveer je je SAP alleen door bij 40 graden te zetten? Dit is vaak niet voldoende om ook je RE's te inactiveren...
-
- Berichten: 8
Re: transformatie van Ncor - CFP
De grootte van NcoR is 10092bp maar de grootte van CFP-C1 weet ik niet verder ik inactiveer SAP gedurende 15 minuten bij 65 graden (heat block)
-
- Berichten: 740
Re: transformatie van Ncor - CFP
Ik weet het zo niet uit mn hoofd, maar bij 15 min. op 65 graden deactiveer je volgens mij je RE's niet. Het kan dus zijn dat je insert tijdens de ligatie niet in de vector wordt geplaatst.
Verder is je lengte ok, dat hoort geen probleem te zijn.
Ik denk dat het dus licht aan je werkwijze (transformeren, deactiveren enz.).
Verder is je lengte ok, dat hoort geen probleem te zijn.
Ik denk dat het dus licht aan je werkwijze (transformeren, deactiveren enz.).
-
- Berichten: 8
Re: transformatie van Ncor - CFP
nogmaals bedankt roy
Je hebt gelijk het ligt aan mijn werkwijze ik probeer nu inactivatie v SAP wat langer te doen ipv 15 min by 65graden probeer ik het wel by 30 min 68 graden hoe lijkt je dat zal dat werken denk je???? , verder denk ik dat tranformatie wel goed is maar de ligatie is het probleem dit wil niet lukken dus elke suggestie met betekking tot het lukken van de ligatie is welkom
groetjes JASMIN
Je hebt gelijk het ligt aan mijn werkwijze ik probeer nu inactivatie v SAP wat langer te doen ipv 15 min by 65graden probeer ik het wel by 30 min 68 graden hoe lijkt je dat zal dat werken denk je???? , verder denk ik dat tranformatie wel goed is maar de ligatie is het probleem dit wil niet lukken dus elke suggestie met betekking tot het lukken van de ligatie is welkom
groetjes JASMIN
-
- Berichten: 740
Re: transformatie van Ncor - CFP
Mijn standaard protocol:
+/- 30 min SAP deactiveren op 65 graden. (Meestal doe ik echter EtOH prec. omdat er ook nog RE's aanwezig zijn).
Ligatie:
1ul vector
1ul T4 ligase
2ul Buffer
.ul Insert
.ul MilliQ
--
20 ul
De insert / vector ratio houdt ik altijd op 3:1.
De ligatie voer ik uit bij 4 hrs. op kamer temp.
Transformatie:
- E.coli's uit -80 halen en op ijs plaatsen.
- 5 ul ligatie product toevoegen (nooit mixen!)
- Terug op ijs plaatsen voor 45 min
- 45 sec heatshock bij 42 graden en 2 min terug op ijs plaatsen
- 350 ul SOC medium (of LB) toevoegen
- 45 min incuberen in schutstoof
- Cellen uitplaten op LB-kan. platen
Volgende dag kolonies bekijken.
Ik hoop dat dit genoeg info is.
+/- 30 min SAP deactiveren op 65 graden. (Meestal doe ik echter EtOH prec. omdat er ook nog RE's aanwezig zijn).
Ligatie:
1ul vector
1ul T4 ligase
2ul Buffer
.ul Insert
.ul MilliQ
--
20 ul
De insert / vector ratio houdt ik altijd op 3:1.
De ligatie voer ik uit bij 4 hrs. op kamer temp.
Transformatie:
- E.coli's uit -80 halen en op ijs plaatsen.
- 5 ul ligatie product toevoegen (nooit mixen!)
- Terug op ijs plaatsen voor 45 min
- 45 sec heatshock bij 42 graden en 2 min terug op ijs plaatsen
- 350 ul SOC medium (of LB) toevoegen
- 45 min incuberen in schutstoof
- Cellen uitplaten op LB-kan. platen
Volgende dag kolonies bekijken.
Ik hoop dat dit genoeg info is.
-
- Berichten: 8
Re: transformatie van Ncor - CFP
bedankt ik zal je protocol volgen hopelijk lukt het nu wel thxxxxxxxx
-
- Berichten: 740
Re: transformatie van Ncor - CFP
succes! Laat maar horen van het resultaat is.
