Effect NaCl op affiniteit Ab's

Kirihitiana

Hallo,

Ik ben bezig met antilichaam zuivering d.m.v affiniteits chromatografie. Ik ben een stagiaire, zonder verdere ervaring hiermee dus ik verontschuldig mij als ik domme vragen stel.

In een van de handleidingen van het apparaat (ÄKTAexplorer 100) staat dat de NaCl concentratie 150mM moet zijn van de bindingsbuffer. Je monster moet dezelfde concentratie hebben voor optimale binding.

Voorheen werd dit niet gedaan, maar sinds ik er werk wel om te kijken of er verschil is qua opbrengst. En dit is ook gebleken.

Een vraag van een collega is hoe dit kan. Omdat een verhoogde concentratie aan NaCl juist elutie zou veroorzaken volgens hem.

Kan iemand mij vertellen hoe dit zit? Wat voor invloed heeft NaCl op de binding van antilichaam op het ligand (in ons geval IgG (Fc fragment) op proteïne A)

Onze buffers:

Binding: Na₂HPO₄ + NaH₂PO₄ + 150 mM NaCl (pH 7,2)

Elutie: Citroenzuur + Na-Citraat (pH 3,2)

Weet zo de molariteiten verder niet meer uit het hoofd.

ps. Ik weet dat dit een chemieforum is, maar ik weet even niet waar ik anders over dit kan vragen.

Napoleon1981

Don't worry, dit hoort zeker thuis op dit forum. Ik heb zelf weinig ervaring met dit soort dingen, maar heb als chromatographer wel wat ideeen, en kan er een theorie oplos laten. Als niemand het voor 100% weet zal ik je proberen verder te helpen...

Napoleon1981

Ok mijn redenatie dan maar.

Het draait om de interactie van je analiet met het antilichaam in dit type assays. Wat je dus wilt is dat het antilichaam zich zo "open" mogelijk stelt voor het analiet. Omdat in dit geval je antilichaam een proteine is, zullen dingen als een pH en ionsterkte een belangrijke rol spelen in de conformatie van de proteine en dus bepalend zijn voor de analiet/antilichaam interactie.

In dit geval is dus de een ionic strenght van 150mM NaCl bij een pH van 7,2 optimaal voor de binding. Je collega is denk ik in de war met ionexchange chromatografie, waar NaCl in water vaak gebruikt wordt als elutie vloeistof vanwege de counterion sterkte. Dit principe is hier totaal niet aan de orde.

Elutie geschiedt door de conformatie van het antilichaam te veranderen waardoor de interactie antilichaam/analiet verbroken wordt, in dit geval dus aanzuren (dit is iets waar proteinen over het algemeen slecht tegen kunnen).

Conclusie gebruik de voorgeschreven buffers etc, in plaats van het wiel opnieuw uit te vinden, zeker als je niet goed weet waar je mee bezig bent.

Kirihitiana

Bedankt voor je reactie Napoleon. Ik ben er vandaag ook al uitgekomen met andere collega's. We gaan binnenkort ion-exchange chromatografie doen, dus ik denk dat hij in de war was. Niet zo handig natuurlijk als ik alles probeer te begrijpen wat ze allemaal vertellen.

Mijn conclusie: opgelost

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Effect NaCl op affiniteit Ab's

Effect NaCl op affiniteit Ab's

Re: Effect NaCl op affiniteit Ab's

Re: Effect NaCl op affiniteit Ab's

Re: Effect NaCl op affiniteit Ab's