Con A affiniteits chromatografie hexameer eiwit

evelinehoebe

Ik wil een, door de cellen uitgescheiden, hexameer eiwit uit medium zuiveren met Concanavalin sepharose beads. Mijn eiwit is N-linked en O-linked high mannose geglycosyleerd en in de hexameer structuur steken de suikers naar het midden van de ring. Mijn eiwit bindt aan de beads en elueert ook weer.

Als ik de flowthroughs van de wasstappen en de elutie stappen op westernblot zet, dan doet mijn monoclonale antibody tegen de N-terminus het niet meer. Het polyclonale antibody doet het nog wel.

Dit is een teken dat er iets is veranderd in de vouwing van mijn eiwit.

Dat is niet de bedoeling, want ik wil mijn eiwit in zijn natuurlijke vouwing, na zuivering, op cellen testen; misschien beinvloedt de vouwing de werking van mijn eiwit.

Ik heb getest of de zoutconcentratie het probleem was, maar dat heeft geen invloed. Het is waarschijnlijk toch het ConA zelf.

Ik denk dat, omdat de suikers in het midden van de hexamere ring zitten, dat het binden van ConA aan deze suikers de structuur verandert.

Heeft iemand een idee hoe ik kan zorgen dan mijn eiwit weer terug vouwt?

Bedankt!

Napoleon1981

Wat zijn de was stappen en de elutie stappen?

evelinehoebe

Dit experiment is gedaan met 250ul ConA-sepharose bead-slurry van Sigma. Ik heb qua hoeveelheden buffer gekeken naar was meestal wordt gebruikt bij een mini-His-Spin protocol.

Beads voorwassen (3X) met wasbuffer volgens Sigma (1M NaCl, 5mM MgCl2, 5mM MnCl2, 5mM CaCl2)

De beads vervolgens wassen met Equilibration-buffer volgens Sigma (20mM Tris pH 7.4, 0,5M NaCl)

Sample (=celculture medium) is 1:1 verdund met deze buffer.

De was stappen (3X) zijn ook gedaan met deze eq.buffer.

Elutiebuffer= Methyl-alpha-D-glucopyranoside in MQ

E1=5mM

E2=10mM

E3=50mM

E4=100mM

E5=500mM

Mijn eiwit kwam in 2 pieken van de beads los; bij E1 en bij E3/4. Dit laat mij denken dat het eiwit gedeeltelijk ontvouwt en er misschien twee vormen zijn.

Vannacht heb ik een poging gedaan om een mini dialyse te doen van mijn ongeveer 60ul die ik nog over heb van mijn Eluties. Dit om het suiker te verwijderen. Het zou kunnen dat mijn eiwit dan terug vouwt.

Ga ik nu Westernblotten op non-reducing blot om te kijken of ik de hexameer nu wel zie.

Napoleon1981

Ik zie ook inderdaad niet zo waar het mis gaat. Ik kan alleen de dingen bedenken die jij zelf aan gegeven hebt.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Con A affiniteits chromatografie hexameer eiwit

Con A affiniteits chromatografie hexameer eiwit

Re: Con A affiniteits chromatografie hexameer eiwit

Re: Con A affiniteits chromatografie hexameer eiwit

Re: Con A affiniteits chromatografie hexameer eiwit