His Tag zuivering

placebo

Hoi iedereen,

Ik zit al een tijdje met een vraagje en ik kom er niet echt uit.

Ik heb een eiwit met een 6x his tag gezuiverd met behulp van een Ni²⁺-NTA kolom op een FPLC. Nu is het een eiwit wat oplosbaar in het cytoplasma. Het eiwit is tot expressie gekomen in een E.coli BL21(DE3)plysS wat het T7 expressie systeem bevat. Hierdoor kan het dus zijn dat door de hoge expressie zogenaamde inclusion bodies gevormd zijn. De inclusion bodies zijn niet oplosbaar. Nu heb ik helaas niet kunnen controleren of ik onder gedenatureerde omstandigheden resultaat had van mijn zuivering, echter onder natieve omstandigheden had ik resultaat (met een 10mM imidazole concentratie in de was buffer).

Wat mijn vraag nu is is waarom moet ik eiwitten welke oplosbaar zijn op natieve wijze zuiveren en eiwitten die niet oplosbaar zijn onder gedenatureerde omstandigheden zuiveren ?

Los van die ene keer dat het His tag toevallig middenin de eiwit structuur zit en dus niet aan de matrix kan binden.

mvg Kevin

RubenM

Aggregaten in welke vorm dan ook zijn natuurlijk nooit handig. Ze binden - zoals je zelf al aangeeft - beroerd aan je nikkel én je weet nooit wat er eventueel nog aan rommel in het aggregaat opgesloten geraakt is. Van zuivering komt dan dus helemaal niets terecht. Door je eiwit te denatureren worden niet alleen secundaire en tertiaire structuurelementen verstoord, maar wordt ook het aggregaat als geheel uit elkaar gepeuterd. Voor binding van een His-tag aan nikkel maakt het niet uit of je een geheel ontvouwen eiwit of een goed oplosbaar gevouwen eiwit hebt.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

His Tag zuivering

His Tag zuivering

Re: His Tag zuivering