Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

PlayboybunnieJ

Goedendag, ik heb even een vraagje, want ik kom er echt niet uit..

We hadden voor ons project een zedenzaak. Hierbij wilden we de mannelijke van de vrouwelijke cellen scheiden. De vrouwelijke cellen wilden we kwijtraken.

We hebben het volgende gedaan:

We hebben stukjes stof ontvangen (met daarop mogelijk sperma) en een wattenstaafje (uitstrijkje van het vrouwelijke slachtoffer). Deze hebben we in fysiologisch zout laten weken, om de aanwezige cellen eraf te laten weken. Vervolgens hebben we SSC-buffer toegevoegd. In SSC-buffer zit Sodium-Chloride Sodium-Citraat (toch?). Het dient als wasbuffer, maar wat wast het dan precies weg? Alles wat geen vrouwelijke epitheelcel/spermacel is?

Klopt het dat er in SSC-buffer Sodium-Chloride Sodium-Citraat zit of ga ik hier al de mist in?

Wat verwijdert SSC-buffer precies??

Vervolgens centrifugeer je, en verwijder je het supernatant. Deze stap herhaal je nog een keer. Ik neem aan dat het dus dient om de vuiligheid (lees: pluisjes en dergelijke???) weg te wassen. Klopt dat????

Hierna hebben we NaAc toegevoegd (0.2 M).

Wat doet NaAc precies? Het Natrium gaat aan de buitenkant van het DNA zitten, aan de fosfaatgroep, maar we hebben nog geen cel kapot gemaakt.. Hoe kan het dan toch aan de buitenkant van het DNA gaan zitten??? Zorgt het er alleen voor dat het DNA dan bij elkaar gehouden word? Of wat is de functie dan van NaAc tijdens deze analyse??

Vervolgens hebben kort gevortext om te mengen en vervolgens (10%) SDS en prot K toegevoegd. De SDS zorgt ervoor dat de celwanden, vetten en eiwitten worden weggewassen, want het is een soort zeep, vervolgens zorgt de prot K onder 55 graden ervoor dat de eiwitten worden afgebroken, die de SDS dus dan ook wegwast. Het DNA is dan dus wel vrijgekomen, en dan kan NaAc het bij elkaar houden/neerslaan omdat dat er ook nog inzit, maar wat is precies het product wat ervoor zorgt dat die vrouwelijke cellen kapot gaan dan, want dat puzzelstukje mis ik.

Wij hebben vervolgens al het vrouwelijke DNA en de celwanden ervan eraf gepipetteerd en dat zijn we kwijt. Hierna hebben we alle voorgenoemde stappen herhaald, waarbij de kans groot is dat onze spermakoppen al kapot zijn gegaan. We hebben wel DTT toegevoegd samen met de SDS en prot K stap. Wij gingen er vanuit dat dit de spermacellen kapot zou maken en zo het DNA laten vrijkomen, maar er is mij verteld dat bij het centrifugeren na toevoeging van SSC-buffer, we onze spermakoppen waarschijnlijk al kapot hebben gemaakt en het later (bij verwijdering van het supernatant) waarschijnlijk dus ook mee eruit hebben gepipetteerd. Ik snap er niks meer van. Kunt u me alstublieft helpen en corrigeren waar nodig? Kunt u me ook zeggen welke van mijn aannamens WEL goed is?

Alvast bedankt..

Groetjes.

Fuzzwood

Ik weet het niet zeker (ben geen bioloog) maar ken je het begrip osmose en wat er gebeurt als er teveel vocht een cel binnenloopt?

chochoo

hoi bunnie,,

#1. Je SSC buffer is saline sodium citraat. Het bestaat uit sodium chloride en trisodium citraat. Deze buffer dient als een soort wasbuffer, het wast de onzuiverheden weg die in de oplossing zitten, zoals kleine restjes van de stof waar het semen aanzat...

#2. Ja dat klopt, je wast de pellet 2x

#3. Natriumacetaat dient als buffer om de pH constant te houden (ik denk voor de prot. K die je later toevoegt).

#4. De SDS zorgt er niet alleen voor dat je celmembraan oplost, maar zorgt ook dat prot. K extra goed werkt.

De eiwitvervuiling wordt verwijderd bij de phenol/chloroform scheiding, dit wordt NIET gedaan door SDS.

#5. Ik weet niet van wie je dat gehoord heb over de SSC buffer.. Maar het zit zo:

De DTT zorgt ervoor dat de sulfaatbindingen in het acrosoom van de spermakop kapot worden gemaakt. Zo kan de SDS de celmembraan kapot maken en komt het mannelijk DNA dus vrij. Dit gebeurt pas bij de stap waarbij je DTT en SDS enzo toevoegd aan het mannelijk pellet.

Eerder dan die stappen gebeurd er niks met de spermacellen omdat deze te hard zijn om aangetast te worden, in tegenstelling tot het vrouwelijk DNA.

groetjes,

Martin FO2

nog meer vragen, stel ze dan ff.. leer ik ook gelijk voor de her

PlayboybunnieJ

Ik weet het niet zeker (ben geen bioloog) maar ken je het begrip osmose en wat er gebeurt als er teveel vocht een cel binnenloopt?

Ik dacht dus inderdaad ook dat de SSC-buffer diende om de osmotische waarde op peil te houden en hierdoor cellen te laten knappen, maar dat is dus niet het geval. Ik heb vorige week al mondeling gehad over deze stoffen, en die aanname klopte dus niet.. Ik denk dat chochoo helemaal goed zit. Het waren puzzelstukjes in de puzzel die ik miste, ik ga het ff goed doorlezen, maar ik denk dat daarmee mijn puzzeltje rond is!

Hahahaha chochoo is die blowert, samen met Stef of niet? 8-[

De DTT zorgt ervoor dat de sulfaatbindingen in het acrosoom van de spermakop kapot worden gemaakt.

Eh.. Zijn het niet de zwavelbindingen die aan eiwitten vastzitten die in het celmembraan van het acrosoom van de spermakop zitten?? Het acrosoom is dat enzym dat ervoor zorgt dat de spermatozoïde kan binnendringen in het eicelletje en zo tot bevruchting kan overgaan toch??

KNIP door Beryllium: krachttermen mbt geloof doen we maar niet.

PlayboybunnieJ

Fysiologisch zout  Cellen losweken

SSC-buffer  Sodium-Chloride Sodium-Citraat. Dient als een soort wasbuffer. Wast onzuiverheden die in de oplossing zitten zoals kleine restjes stof waar het op semen opzat/kleurstof van spijkerstof etc weg. De cellen blijven intact, had net zo goed fys zout voor deze stap kunnen worden gebruikt. Het wast in water oplosbare verontreiniging weg.  Eigenlijk verdun je de verontreiniging heel sterk door te wassen met SSC  afdraaien  bovenstaande vloeistof weg pipetteren  weer wassen. Gewassen cellen (vaginale EN spermacellen). Je hoopt hiermee veel potentieel storende factoren te hebben weggewassen.

NaAc  Schermt lading van het DNA af. Je zou ook eerst SDS kunnen toevoegen.

latere werking na toevoeging van SDS + Prot K  DNA bij elkaar duwen, gaat aan fosfaatgroepen van het DNA (buitenkant) zitten  lading afschermen dus.

SDS  lost vetten op. Door de vet oplosbare eigenschap van SDS worden de celmembranen opgelost. (De celmembranen van vaginale cellen bestaan uit een dubbele lipidelaag (vetlaag)). De eiwitvervuiling word pas verwijdert bij toevoeging van fenol/chloroform/isoamyl alcohol! NIET door SDS.

Prot K  is een proteinase die eiwitten afbreekt, het maakt tevens de histonen kapot, zodat het DNA goed vrijkomt. Dit is nodig omdat je anders door de fenol in de latere stappen je DNA mee precipiteerd in de eiwitlaat (DNA bindt namelijk goed aan histonen).

De vrouwelijke celmembranen lossen op door inwerking van het SDS en de protK. De sperma koppen lossen in deze oplossing veel minder goed op omdat de eiwitten in het laagje om het celmembraan van de spermacellen sterk aan elkaar zijn gekoppeld door de aanwezigheid van zwavelbruggen. (de spermacellen kunnen dus veel langer stand houden in deze oplosbuffer). Na afdraaien zitten de gelyseerde (opgeloste) vrouwelijke cellen in het supernatant (vloeibare fase) en de koppen in het pellet.

DTT  Aan het pellet voeg je weer SSC toe met ProtK en SDS en TEVENS DTT. DTT

is in staat de zwavelbruggen te verbreken waardoor de SDS en protK nu wel de spermakop kunnen lyseren en het DNA vrij in oplossing komt.

Fenol/chloroform/isoamyl alcohol  Zorgt voor 3 lagen. Onderste laag/organische laag: vetten fenol/chloroform. Middelste laag: afgebroken eiwitten en histonen. Bovenste laag/waterfase: DNA

Prot K word direct kapot gemaakt door fenol  Prot K komt in de middelste laag terecht.

100% ethanol(-20 graden)  DNA verdrijven/neerslaan, DNA komt bij elkaar te zitten.

70% ethanol  in het pellet het vuil wegwassen, het DNA word niet opgelost maar eiwitten/vetten worden kapot gemaakt en doordat je het supernatant verwijdert ook mee weggegooid.

TE-buffer  Tris + EDTA Tris is de buffer. Heeft een pH van 7.0 tot 9.2. EDTA vangt metalen weg/inactiveert nucleases.

chochoo

ja klopt, niet echt fijn dat ik bekend sta als 'die blowert met Stef' xD

maar om terug te komen op de vragen, het zijn inderdaad zwavelbindingen.

Sulfid in het engels lijkt gewoon op sulfaat daarom.

Dat hele verhaal met uitleg van de stoffen hierboven klopt ook..

Nu moet je nog Oligo leren en hoe het zit met de primers, als je dat nog niet wist.

Je kan veel info erover vinden in de reader van Genetica. Als je die niet heb stuur ik hem wel via mail.. [!]

bryandakillah

Weet je ook toevallig waar de K voor staat in Prot K. ?

Bryan

Beryllium

Ook hier geen bioloog, maat ik zou zeggen dat protK staat voor Proteïne Kinase.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Re: Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Re: Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Re: Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Re: Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Re: Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Re: Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc

Re: Zedenonderzoek SSC-buffer/NaAc