primers long template PCR

chief_CF

Ik zal even inleiden wat een long template PCR is.

Het is bedoeld voor stukken template van minimaal 10kilobasenparen.

Omdat dit zo een lang stuk is gebruik ik hier speciale enzymen voor.

Alleen alle kitjes die ik tegen ben gekomen raden primers aan van minimaal 25 nucleotiden tot 32. En het is zelfs gebruikelijk om rond de 30 te zitten. Dat is super veel, ik snap wel dat het wat van doen heeft met het GC gehalte, de optimale condities daarvan is tussen de 0,45 en de 0,65.

Alleen nou mijn vraag>

Waarom is het zo belangrijk dat de lengte van de primers meer dan 25 nt horen te zijn. Terwijl voor een normale PCR je rond de 20 nt al genoeg hebt.

Uit ervaring weet ik dat primers van 30 baseparen goed werken, alleen de kans op mismatches en hairpins worden vergroot. En als je veel kleinere primers maakt dan is de kans op a specifieke binding groter. Wat is dan het nu van lange primers?

heeft het iets te maken met hoe langer en hogere GC waarde hoe hoger de Tm en dat dat een bepaalde invloed heeft waarom een long template PCR beter werkt?

PCR programma long template PCR=

Stap Temperatuur Tijd Rondes

Denaturatie 92 2minuten 1x

Denaturatie 92 30sec 35x

Annealing 58 1minuut

Elongatie 68 10minuten

Elongatie 68 7minuten 1x

Koeling 20

Tm van de primers is 67.

Roy van Heesbeen

Geen idee waarom ze langer moeten zijn, 30 is niet super veel, ik heb ook wel eens een gewone PCR's gedaan met primers van >50 nucleotiden en dat werkt ook prima. Naar mijn idee maakt dit dus niet veel uit. De enige reden die ik kan bedenken is de kans op niet-specifieke bindingen verkleinen.

chief_CF

tuurlijk kan een PCR met primer met meer dan 50 nucleotiden werken, als je de sequentie 100 procent zeker weet en het DNA niet snel veranderd, muteert of iets dergelijks, dan lukt t gewoon.

maar bij mijn onderzoek weet ik niet zeker of ze zullen passen, het is simpelweg trial and error. maar dat is ook niet de vraag.

waarom moeten ze die lengte zijn?

dat ze zo lang moeten zijn wordt veel beschreven, maar de waarom wil ik weten.

Colombo_inc2

chief schreef: tuurlijk kan een PCR met primer met meer dan 50 nucleotiden werken, als je de sequentie 100 procent zeker weet en het DNA niet snel veranderd, muteert of iets dergelijks, dan lukt t gewoon.

maar bij mijn onderzoek weet ik niet zeker of ze zullen passen, het is simpelweg trial and error. maar dat is ook niet de vraag.

waarom moeten ze die lengte zijn?

dat ze zo lang moeten zijn wordt veel beschreven, maar de waarom wil ik weten.

Begrijp ik goed dat je met deze PCR een fragment met wisselende sequentie wilt gaan amplificeren?

Als je niet zeker weet of je primer exact overeenkomt met je DNA template dan kan ik me voorstellen dat lange primers één mismatch wel kunnen tolereren. Mogelijk dat dit dus de noodzaak is van een 30n primer.

Verder bevat de PCR speciale enzymen waarbij ook 3' - 5' exonuclease activiteit (proof reading) aanwezig is. Hiervan is bekent dat deze ook single strand DNA vernietigen, dus je primers KUNNEN langzaam degraderen. Een langere primer kan enige degradatie hebben zolang de 5' kant maar goed annealed met template DNA.

Je kunt overigens ook primers laten synthetiseren die ongevoelig zijn voor dergelijke afbraak.

TK

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

primers long template PCR

primers long template PCR

Re: primers long template PCR

Re: primers long template PCR

Re: primers long template PCR