Momenteel ben ik bezig met het detecteren (en genotyperen) van het Humaan Papilloma Virus (HPV) in tumoren. Dit doet ik met behulp van een multiplex qPCR met het Taqman principe, waarbij gebruik wordt gemaakt van genomisch DNA (géén RNA). Het DNA is verkregen door het gebruik van de QIAamp DNA kit, heeft een A260/280 van 1.79 en er is 25 ng DNA gebruikt per PCR reactie. Vanwege geheimhouding kan ik maar beperkte informatie geven betreft de techniek zelf, so bear with me.
We hebben een vijftal kanalen (voor nu resp. A, B, C etc. genoemd) en een vijftal primer/probe mixen die elke 4/5 verschillend gelabelde probes bevat en 4/5 primer sets voor het specifiek detecteren van een HPV type (mixen worden resp. 1, 2, 3 etc. geneomd). In kanaal A meet je enkel de fluorescentie van de probe, behorende bij de interne controle (beta-globine). Zie figuur 1.
Figuur 1: Een vereenvoudigd genotypering schema waarbij de betreffende kanalen en multiplex primer/probe mixen zijn weergegeven.
Ik heb één sample waarbij alle beta-globine controles nagenoeg negatief tot zwak eruit zien, waardoor we dus zouden denken dat de DNA input niet in orde is... en de kans op een vals-negatieve HPV uitslag groter is (zie figuur 2). Echter zie ik dat er in mix 3 bij kanaal D toch een positieve uitslag komt met een Cp-waarde van 30,96 (zie figuur 3).
Figuur 2: Amplificatie curves van het sample (zwart), de negatieve (rood) en positieve (groen) controles van alle mixen gemeten bij kanaal A.
Figuur 3: Amplificatie curves van het sample (zwart), de negatieve (rood) en positieve (groen) controles van mix 3 gemeten bij kanaal D.
De negatieve controles en de positieve controles die mee zijn genomen in de run voor elke mix zijn overigens allen in orde.
Overigens kan er geen sprake zijn van kruiscontaminatie met DNA van een ander sample, aangezien het HPV type dat bij dit sample gedetecteerd is nog niet is gevonden in andere samples.
Wie herkent die probleem en/of heeft hier een verklaring voor?
