inducible Promotor

Jaffaa

Hallo,

voor een project op school willen wij uit een gistvector de promotor halen om hier vervolgens een andere in te zetten,,

de vector die we gebruiken is een van deze 3 http://www.stonybrook.edu/biochem/dean/resources.html ,, zoals te zien is zit er een gen in voor een RFP eiwit. deze willen dmv een inducible promotor (Metallothionein,, CUPI) aanzetten. als het goed is doet deze promotor het alleen bij aanwezigheid van koperionen.

heeft er iemand een idee hoe we de 'oude' promotor(die standaard in de vector zit) er uit halen en die 'nieuwe' inducible promotor erin zetten.

natuurlijk zullen dmv restrictie en ligatie dit moeten doen, maar wat ik dacht is als we een dubbele digestie op ene van deze vectoren doen dan valt heel de vector uit elkaar en is er weinig kans van succes met het ligeren met de juist promotor.

ik hoor graag van jullie

greets

Sjitty

Wat wij doen is een digest doen op de originele vector met enzym(en) die knippen naast het stukje die je eruit wilt (op restricitesequenties die ook op de acceptor vector liggen uiteraard). Dit digest wordt vervolgens op een agarose gel geladen en gevisualiseerd. Als het gelukt is kan je dan het uitgeknipte stukje zien op een bepaalde hoogte (volgens de grootte van het "insert"). Dit wordt uitgeknipt en het DNA terug geisoleerd en dan gemengd met de 2e opengeknipte vector samen met een ligase om zo het insert te ligeren in de vector. Van dit mengsel wordt een kleine hoveelheid opnieuw op een agarose gel geladen om te controleren of het gelukt is (vector met insert is groter dan oorspronkelijk insert (als het insert groot genoeg is). Maar validatie kan in jullie geval dus ook met die promotorinductie. Het DNA wordt dan in de cel gebracht met een gepaste techniek voor het gebruikte organisme (elektroporatie....).

Jaffaa

Sjitty,

bedankt voor je reactie..

na wat puzzelen zijn we er uiteindelijk uit gekomen hoe we het gaan doen.. De methode die jij beschrijft is inderdaad de methode die we ook gaan gebruiken,, het enige probleem was dat op de punten waar we wilde knippen in ons plasmide haast geen 'unieke' restrictiesites zitten dus zouden we op meerdere plekken knippen waardoor het plasmide uit elkaar valt en dus moeilijker wordt om te ligeren met insert erin..

greets

Sjitty

het is niet erg dat gans je donor plasmide uiteen valt, zolang je insert maar compleet blijft en je hem kan isoleren van de rest in je agaarose gel. M.a.w. dat hij een groot grootte verschil heeft met de andere ontstane DNA nevenproducten. En zelfs al heb je nog wat ongewenste inserts die potentieel ook opgenomen kunnen worden, kan je hiervoor selecteren door je cellen op te groeien op een selectief medium (hopelijk heb je selectiemerkers in je insert zoals antibiotica resistentiemerker..). Dat doe je trouwens zoiezo na transfectie om kolonies te vinden die jouw insert correct hebben opgenomen.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

inducible Promotor

inducible Promotor

Re: inducible Promotor

Re: inducible Promotor

Re: inducible Promotor