Ik heb een vraagje over het contrasteren van een preparaat bij elektronenmicroscopie. Dit gebeurt met zware metalen omdat een preparaat zelf geen contrast heeft.
Men gebruikt vaak Osmium tetroxide (OsO4) om membranen te contrasteren. Men heeft mij verteld dat OsO4vooral bindt op de lange C-ketens maar ook een beetje met de hydrofiele koppen van de lipiden dubbellaag. Men spreekt dan soms van een 'rail-road track' omdat er 2 elektronen dense lagen zijn en ertussen een elektronen transparante laag.
Nu vraag ik mij af of die elektronen transparante laag die lange C-ketens zijn en waarom deze dan lichter gekleurd zijn (want het zijn toch deze die binden met de zware metalen?)?
De elektronen transparante lagen zijn de gebieden met weinig massa en de elektronen dense lagen zijn de gebieden zijn met veel massa (hogere dichtheid).
Elektronen bewegen gemakkelijker door de transparante lagen met een lage dichtheid en ze worden meer verstrooid in gebieden met een hogere dichtheid (ze hebben daar grotere kans om te botsen).
Als die zware metaalionen binden met lange C ketens en niet of veel minder met hun omgeving, dan worden die C ketens dus minder transparant dan hun omgeving. Als die lichter zijn weergegeven op het plaatje dan worden gebieden waar veel elektronen doorheen schieten kennelijk donkerder weergegeven op je plaatje.
OsO4 bindt aan onverzadigde groepen (C=C dubbele bindingen), en dus niet aan de gehele keten. Bij de meeste vetzuren zitten de dubbele bindingen, als ze er zitten, ongeveer halverwege de ketens, zie bijvoorbeeld de structuur van oliezuur.
Aan weerszijden zitten een aantal enkelvoudig gebonden C-atomen. Het donkergekleurde gedeelte is waar het OsO4 gaat zitten (de dubbele bindingen dus). Het lichtgekleurde gedeelte zijn die C-C bindingen in de rest van de keten. Gezien het feit dat de vetzuur-resten in de dubbellaag met hun apolaire uiteindes tegen elkaar liggen zul je 2 donkere gedeeltes zien met een klein stukje licht ertussen.
ik heb ondertussen de correcte oplossing gekregen: OsO4bindt met de hydrofiele koppen en met de hydrofobe staarten (deze worden dus allebei zwart) maar aangezien een membraan een dubbellaag van fosfolipiden is (en deze sluiten niet perfect op elkaar aan) is de elektronen transparante laag de ruimte tussen beide lagen fosfolipiden.
Dat geloof ik niet, want dat zou betekenen dat de ruimte tussen beide lagen, zelfs waar deze niet perfect aansluiten, groter is dan de resolutie van een TEM.
Of op een andere manier bekeken: De "tramrails" plaatjes laten 2 lijnen zijn met een bepaalde dikte. Ertussen een afstand ongeveer vergelijkbaar met de dikte van de lijnen. Dat betekent dat er tussen de vetzuurstaarten een hoeveelheid "niets" zou zitten die net zo groot is als de vetzuurstaarten zelf!
Ja, daar kan je wel gelijk in hebben want op de afbeelding is de witte ruimte ongeveer even groot als de 2 zwarte... Ik zal eens een mailtje sturen naar mijn leerkracht.
"Voor wat OsO4 betreft: deze stof heeft affiniteit voor de hydrofiele koppen van de fosfolipiden maar kan ook cross-linking veroorzaken tussen de lange CH ketens, op plaatsen waar er HC=CH bindingen voorkomen. Hierin ligt de waarde van OsO4 in het bewaren van membranen (fosfolipiden) bij verdere ontwatering. Os zal zich dus ook uitstrekken over de lange hydrofobe keten. De afwisseling e-dens/e-lucent/e-dens is dus niet enkel toe te schrijven aan binding ter hoogte van de hydrofiele koppen maar ook aan cross-linking (eventueel over een bepaalde afstand) van de CH ketens."
