Kan sticky DNA met PCR vermeerderd worden zonder dat het wijzigt?

ch3mtech

Hallo,

Ik ben mijn kennis van biotechnologie aan het verdiepen en ik kwam op deze vraag. Er wordt een gewenst stuk dna van andere cel geknipt met de restrictie enzymen van een plasmide het zijn sticky ends en ik wil dit terug in het plasmide krijgen. Kan ik met pcr methode meerdere sticky dna krijgen zonder dat het blunt ended wordt zodat het er weer in past? Of is het niet nodig dat het sticky dna moet zijn?

Alvast bedankt,
Thibault,

Wouter_Masselink

Je kan elk* DNA fragment middels PCR vermeerderen. Het product is echter wel blunt. Dit hoeft geen probleem te zijn aangezien je bijvoorbeeld middels TA cloning, of Gibson assembly heel deftig je product in je plasmide kan plaatsen. Of er mutaties in je PCR product komen kan een mogelijke zorg zijn. Gebruik daarom altijd een polymerase met proofreading. Phusion en Pfu polymerase zijn hier populaire voorbeelden van. Ik ga tegenwoordig standaard voor een Gibson assembly. Dit is eigenlijk altijd sneller en eenvoudiger dan restrictie cloning, zolang je een goed PCR product kan maken. De commercieel beschikbare kit is relatief duur, dit is op te lossen door een halve of soms zelfs een kwart reactie te doen. Dit geeft veelal nog steeds meer dan genoeg colonies na transformatie. Alternatief kan je zelf ook de gibson reactiemix maken. Dit is alleen nuttig in de context van een hele onderzoeksgroep of instituut.

* je zal specifieke primers moeten weten te ontwerpen en er is natuurlijk een realistisch minimum en belangrijker maximum lengte van je fragment.

ch3mtech

Hallo,

Echt bedankt voor uw meesterlijke uitleg

ch3mtech

Ik had juist nog een vraagje: Hoe weet polymerase of het links of rechts van de primer moet inbouwen?

Alvast bedankt,

Wouter_Masselink

De polymerase weet niet wat links en rechts is, wel gaat de polymerase altijd in de 3'-5' richting over de template strand.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Kan sticky DNA met PCR vermeerderd worden zonder dat het wijzigt?

Kan sticky DNA met PCR vermeerderd worden zonder dat het wijzigt?

Re: Kan sticky DNA met PCR vermeerderd worden zonder dat het wijzigt?

Re: Kan sticky DNA met PCR vermeerderd worden zonder dat het wijzigt?

Re: Kan sticky DNA met PCR vermeerderd worden zonder dat het wijzigt?

Re: Kan sticky DNA met PCR vermeerderd worden zonder dat het wijzigt?