Counterselectie methoden

Moderator: ArcherBarry

Forumregels
(Middelbare) school-achtige vragen naar het forum "Huiswerk en Practica" a.u.b.
Zie eerst de Huiswerkbijsluiter
Reageer
Berichten: 12

Counterselectie methoden

Dag dames en heren
 
Ik had gewoon een simpel vraagje voor jullie. Ik heb tijdens mijn stage enkele counterselectie methoden (in de biotechnologie ter verduidelijking) getest en ik vraag mij af of iemand van jullie in zijn labo gebruikt maakt van counterselectie. Het principe is geweldig: klonering geslaagd -> kolonies met het juiste genotype, klonering niet geslaagd -> weinig of geen kolonies. Ik testte onder meer NiCl2, <i>fusaric</i> acid en thymine (op m9 medium) in combinatie met een tetA/thyA cassette en sucrose in combinatie met een sacBR gen. Hoewel het idee geweldig is kreeg ik de methoden moeilijk aan de praat. Counterselectie lijkt me van zo veel factoren afhankelijk dat ik me op deze moment moeilijk kan inbeelden dat het echt praktisch is om dit in een labo te gebruiken. Maakt iemand van jullie gebruik van counterselectie? En zo ja, onder welke omstandigheden krijgen jullie de methoden te werken? Bedankt voor alle feedback  :)
 
 

Gebruikersavatar
Berichten: 8.557

Re: Counterselectie methoden

Kloneren in de context van plasmides? Met de hedendaagse methoden zoals gibson assembly is dat eigenlijk niet meer nodig. Deze methoden zijn dusdanig efficient dat je geen verdere selectie (behalve amp voor transformatie) hoeft te doen.
 
Counter selectie in de context van BACs en hele chromosomen kan wel nuttig zijn.
http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n1/full/nmeth.1803.html
"Meep meep meep." Beaker

Berichten: 12

Re: Counterselectie methoden

Hoi Wouter, bedankt voor je antwoord en het artikel :). Op mijn stageplek gebruikten ze als kloneringstechniek de Golden Gate Assembly. De lengte van de sticky ends is gemiddeld kleiner dan bij een Gibson Assembly, dus ik vermoed dat daarom de efficiëntie een stuk lager ligt. Dus de counterselectie methoden lijken nuttig om sneller transformanten met het juiste genotype te selecteren. In mijn ondervinding lijken ze wel moeilijk op punt te stellen. Maar als je eenmaal de voorwaarden hebt voor je lab is het een geweldige tool :D

Gebruikersavatar
Berichten: 8.557

Re: Counterselectie methoden

Golden Gate Assembly kan nuttig zijn en heb ik in het verleden ook gebruikt. Voornamelijk in de context van het meervoudig gebruiken van dezelfde inserts kan het heel nuttig zijn. Als je echter telkens andere insert gebruikt dan is Gibson veel makkelijker, sneller en vaak ook goedkoper. Toen ik de Golden Gate Assembly gebruikte was een AMP selectie vaak genoeg. Een aantal kolonies testen (5 a 6) en je hebt eigenlijk altijd wel een goed resultaat. 
 
Soms loop je toch tegen hardnekkige problemen aan, die je vaak met een Gibson eenvoudig op kan lossen. De exact mix kan je zelf samenstellen en is dan ook spot goedkoop. Alternatief als je een commercieel beschikbare versie gebruikt, dan kan je zelfs met een kwart reactie toe. Ook hier wil je met een AMP selectie kolonies selecteren. Het beste is vaak om het AMP gen over twee fragmenten te laten lopen. Zodoende zullen alleen kolonies waar de assembly daadwerkelijk heeft gewerkt, kolonies opleveren.
 
OpenWetWare heeft een goed protocol beschikbaar.
http://www.openwetware.org/wiki/Gibson_Assembly
"Meep meep meep." Beaker

Reageer